过表达miRNA-29a对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压的作用*

高继勇， 冯占超， 徐京风， 李福海

(1济南市妇幼保健院儿科， 山东 济南 250001； 2山东省单县妇幼保健院保健科， 山东 单县 274300； 3山东省地矿职工医院儿科， 山东 济南 250013； 4山东大学齐鲁医院儿科， 山东 济南250002)

过表达miRNA-29a对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压的作用*

高继勇1， 冯占超2， 徐京风3， 李福海4△

(1济南市妇幼保健院儿科， 山东 济南 250001；2山东省单县妇幼保健院保健科， 山东 单县 274300；3山东省地矿职工医院儿科， 山东 济南 250013；4山东大学齐鲁医院儿科， 山东 济南250002)

目的： 检测微小RNA(miRNA)-29a在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉血管壁组织中的表达，研究过表达miRNA-29a对肺动脉高压大鼠的影响，并探讨其初步机制。方法: 在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠模型上，用实时荧光定量PCR测定肺组织miRNA-29a的表达水平；尾静脉注射miRNA-29a-mimic后，记录大鼠肺动脉压和体循环动脉压，苏木素-伊红染色观察肺动脉组织的形态，Western blot检测肺动脉组织中p-Akt与p-eNOS的蛋白水平。结果: 野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺动脉血管壁组织中miRNA-29a呈低表达；过表达miRNA-29a后，大鼠肺动脉压明显下降，体循环血压无显著变化，肺动脉中膜增厚程度显著减弱，肺血管重构现象不明显，p-Akt与p-eNOS的蛋白水平上调。结论: 过表达miRNA-29a对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压具有改善作用，可能与激活PI3k/Akt-eNOS信号通路有关。

肺动脉高压； 微小RNA-29a； PI3k/Akt-eNOS信号通路

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是以肺动脉压力升高和肺血管阻力增加为特征的、由不同病因导致的综合征。由于肺动脉压力病理升高，引起右心衰竭，被称为“心血管系统的恶性肿瘤”[1]。目前临床上进行手术治疗的风险极高，预后很差；药物治疗仅限于应用内皮细胞舒缩调节因子，如前列腺素类似物等，可以改善肺动脉高压患者的症状，但患者的5年存活率依旧不高[2-3]。

微小RNA(mircoRNA, miRNA)-29家族主要有miRNA-29a、miRNA-29b与miRNA-29c，其中miRNA-29a的编码基因位于7号染色体[4]。研究显示在胚胎期的组织中，miRNA-29不表达或呈低表达，但在成熟后，于肺、肾与心脏等组织细胞中呈高表达，是参与调控动脉粥样硬化形成、发生和发展的主要危险因素[5]。国外有学者在研究小鼠心肌梗死模型与人心肌梗死病例时发现，在心脏梗死区域miRNA-29的表达显著下调，提示miRNA-29可能与心肌细胞的纤维化有关[6]。国内有学者研究发现miRNA-29a对腹主动脉瘤的平滑肌细胞增殖凋亡有影响，过表达miRNA-29a可促进细胞增殖，抑制凋亡[7]。本文观察肺动脉高压大鼠模型肺动脉血管壁miRNA-29a的表达，并通过过表达miRNA-29a，观察野百合碱(monocrotaline,MCT)诱导的大鼠肺动脉高压的变化。

材 料 和 方 法

1 实验动物和试剂

健康Wistar大鼠40只，雄性，清洁级，8～12周龄，体重200～250 g，由山东大学实验动物中心提供，饲养于温度恒定(22±2) ℃、湿度恒定(55±5)%的环境中，给予标准饲料进食，自由饮水。

MCT购自Sigma。将MCT溶于1 mol/L稀盐酸，配置成1%浓度的溶液，用1 mol/L氢氧化钾调节pH值至7.2，用生理盐水配置为10 g/L的溶液备用。miRNA-29a negative control (miRNA-29a-NC)与miRNA-29a-mimic由上海吉玛制药技术有限公司合成；抗Akt和p-Akt抗体购自CST；抗内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)和p-eNOS抗体购自BD。

2 实验方法

2.1 野百合碱诱导肺动脉高压大鼠模型的建立 大鼠进行皮下注射野百合碱溶液60 mg/kg，自由进食、饮水，4周后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，肺动脉高压组大鼠注射相同剂量的生理盐水，行经胸体表彩超鉴定，对比肺动脉主干内径数据与主动脉宽度数据。

2.2 qPCR测定miRNA-29a的表达 取适量正常大鼠与肺动脉高压大鼠的肺组织，剪碎，按照TRIzol说明书裂解细胞，使用氯仿提取总RNA，用紫外分光光度法测定RNA样品的A260值，并进行定量。进行逆转录反应，miRNA-29a的上游引物为5’-CATCTGACTAGCACCATCTGAAAT-3’，下游引物为5’-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3’；内参照U6的上游引物为5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物为5’ -GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。扩增条件为：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s,62 ℃ 40 s，40个循环。PCR扩增完成后，标准曲线和扩增曲线由PCR仪器自动生成，所得结果直接在荧光定量操作系统中进行比较分析，目标基因的相对定量按2-ΔΔCt计算。

2.3 实验分组 实验共分为正常对照组(control组)、肺动脉高压组(PAH组)、空白载体组(miR-29a-NC组)与miRNA-29a-mimic组，每组各10只大鼠。正常对照组不进行造模；造模成功的大鼠随机分为肺动脉高压组、空白载体组与miR-29a-mimic组，miR-29a-mimic组大鼠给予尾静脉注射miRNA-29-mimic，空白载体组给予等量miRNA-29a-NC。

2.4 尾静脉注射miR-29a-mimic 将1 μL(1 nmol)的miRNA-29a-NC或者miR-29a-mimic溶于100 μL PBS中，随后将30 μL Lipofectamine 2000与70 μL PBS相互混合，最后将以上2种混合物混合均匀，并室温放置30 min，使用胰岛素注射器通过尾静脉注射方式注入小鼠体内。

2.5 血流动力学检测 给药完成后，各组大鼠每100 g体重腹腔注射肝素 50 U，5 min后采用10%氨基甲酸乙酯(1 g/kg)腹腔麻醉，经右颈外静脉进行右心室插管术，用20号套管针经右心室穿刺至肺动脉主干，记录大鼠肺动脉压(pulmonary artery pressure，PAP)，退出导管，在近心端结扎右颈外静脉，从右颈总动脉插入导管，记录体循环动脉压(systemic arterial pressure，SAP)。

2.6 肺动脉组织形态 处死大鼠，分离左肺，用15 cmH2O压力沿气管注射4%多聚甲醛，石蜡包埋、切片，进行苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察肺血管形态，计算机图像分析计算中膜厚度占血管直径的百分比(WT%)和中膜面积占血管壁总面积百分比(WA%)。

2.7 Western blot实验 给药完成后，取各组大鼠的肺动脉组织，用RIPA细胞裂解液裂解，提取总蛋白后采用BCA法定量，调整蛋白浓度。取适量裂解产物，上样后进行SDS-PAGE分离，电转至硝酸纤维素膜，加入5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h，孵育相应 I 抗，4 ℃孵育过夜，洗膜后，室温孵育相应 II 抗1 h，洗膜，使用化学发光法试剂盒对PVDF膜进行曝光显影，成像扫描分析系统测定目的和内参照条带的吸光度。

3 统计学处理

全部数据采用SPSS 15.0统计软件进行处理，数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 肺动脉高压大鼠肺组织miRNA-29a的表达

结果显示，肺动脉高压大鼠肺组织中miRNA-29a的表达显著低于正常大鼠，见图1。给予尾静脉注射miR-29a-mimic 4周后，检测大鼠肺组织中miRNA-29a的表达，结果发现注射miR-29a-mimic后大鼠肺组织中miRNA-29a的表达显著升高，见图2。

Figure 1.The expression of miRNA-29a in the lung tissue of pulmonary hypertension rats. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

图1 miRNA-29a在肺动脉高压大鼠肺组织的表达

2 血流动力学检测数据

与正常对照组组相比，肺动脉高压组大鼠的肺动脉压显著升高，右心壁明显增厚；与空白载体组相比，miR-29a-mimic组大鼠的肺动脉压明显下降，右心壁增厚程度减弱；3组大鼠的体循环血压无显著变化，见表1。

Figure 2.The expression of miRNA-29a in the lung tissue of pulmonary hypertension rats after transfection with miR-29a-mimic. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPAH group.

图2 转染miR-29a-mimic后，miRNA-29a在肺动脉高压大鼠肺组织的mRNA表达

3 各组大鼠肺动脉的形态学观察

与正常对照组相比，肺动脉高压组大鼠的肺动脉中膜明显增厚，有显著的肺血管重构现象，内皮细胞损伤、脱落，WT%和WA%显著升高；与肺动脉高压组相比，miR-29a-mimic组大鼠的肺动脉中膜增厚程度显著减弱，肺血管重构现象不明显，WT%和WA%明显降低，见图3、表1。

Figure 3.The morphological observation of pulmonary arteries of rats in each group (×200).

图3 各组大鼠肺动脉形态学观察

表1 各组大鼠血流动力学数据和肺动脉结构变化的比较

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPAH group.

4 p-Akt与p-eNOS蛋白水平的变化

检测各组大鼠肺动脉组织p-Akt与p-eNOS蛋白水平的变化，结果显示肺动脉高压组大鼠p-Akt与p-eNOS的蛋白水平显著下调； miR-29a-mimic组大鼠p-Akt与p-eNOS的蛋白水平明显高于肺动脉高压组，见图4。

讨 论

我们研究发现在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠模型中，肺动脉血管壁组织中miRNA-29a的表达水平比正常大鼠低，提示miRNA-29a在大鼠肺动脉高压的发病机制中具有特异性，推测miRNA-29a在肺动脉高压中可能具有调控的作用。我们给肺动脉高压大鼠尾静脉注射miRNA-29a-mimic，结果显示miRNA-29a-mimic转染后，肺动脉高压大鼠的肺动脉压明显下降，肺动脉中膜增厚程度显著减弱，肺血管重构现象不明显，提示过表达miRNA-29a能够改善肺动脉高压的肺血管重构现象，推测可能是由于过表达miRNA-29a减少了肺组织细胞的凋亡。

Figure 4.The protein levels of p-Akt and p-eNOS. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPAH group.

图4 p-Akt与p-eNOS蛋白水平的变化

PI3K/Akt信号通路是体内非常重要的分子信号通路，而NOS主要存在3种异构体，eNOS是血管内皮细胞产生一氧化氮的主要途径。PI3K通过激活Akt，使Akt发生磷酸化与eNOS磷酸化，从而促进一氧化氮的生成与释放，抑制平滑肌细胞的增殖，降低血管的张力[8-9]。eNOS第1 179位丝氨酸(Ser1179)的磷酸化是调控eNOS活性的关键位点[10]。研究发现Akt激活后，能够增强eNOS Ser1179位点的磷酸化水平从而激活eNOS，生成一氧化氮[11]。我们采用Western blot检测发现过表达miRNA-29a对肺动脉组织中p-Akt与p-eNOS的蛋白水平具有上调作用，推测过表达miRNA-29a后，激活PI3K/Akt-eNOS信号通路，使得Akt与eNOS磷酸化，进一步增加一氧化氮的生成与释放，降低肺动脉血管张力，降低肺动脉的压力，改善右心功能，提高肺动脉高压大鼠的生存时间。同时我们通过对血流动力学的检测，的确发现过表达miRNA-29a后大鼠的肺动脉压明显下降和右心壁增厚程度减弱。

综上所述，miRNA-29a主要是通过激活PI3K/Akt-eNOS信号通路对大鼠肺动脉高压发挥调控作用，因此本实验为寻找慢性炎症型肺动脉高压的新治疗靶点提供了实验基础。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Effects of miRNA-29a on monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats

GAO Ji-yong1, FENG Zhan-chao2, XU Jing-feng3, LI Fu-hai4

(1DepartmentofPediatrics,JinanMaternalandChildHealthHospital,Jinan250001,China;2DepartmentofHealth,ShanxianMaternalandChildHealthHospital,Shanxian274300,China;3DepartmentofPediatrics,Worker’sHospitalofShandongProvincialBureauofGeology&MineralResources,Jinan250013,China;4DepartmentofPediatrics,QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250002,China.E-mail:drlifuhai@126.com)

AIM: To detect the expression of microRNA (miRNA)-29a in pulmonary arteries of monocrotaline (MCT)-induced pulmonary hypertensive rats, and to investigate the effects of miRNA-29a on pulmonary hypertension. METHODS: MCT-induced pulmonary hypertensive model was established in Wistar rats. The expression of miRNA-29a in the lung tissue was determined by qPCR. miRNA-29a was overexpressed in the pulmonary hypertension rats by tail vein injection of miRNA-29a-mimic. Pulmonary artery pressure (PAP) and systemic arterial pressure (SAP) were measured. The morphological changes of the pulmonary arteries were observed by HE staining. The protein levels of p-Akt and p-eNOS were detected by Western blot.RESULTS: The mRNA expression of miRNA-29a was significantly decreased in the pulmonary arteries of MCT-induced pulmonary hypertensive rats. Furthermore, after overexpression of miRNA-29a, PAP was remarkably reduced, while SAP remained unchanged. In addition, the increased thickness of tunica media, the remodeling of pulmonary arteries and the decreased protein levels of p-Akt and p-eNOS in the pulmonary hypertensive rats were dramati-cally changed after miRNA-29a overexpression.CONCLUSION: Overexpression of miRNA-29a ameliorates pulmonary hypertension in rats. These effects may be associated with the activation of PI3K/Akt-eNOS signaling pathway.

Pulmonary hypertension; MicroRNA-29a; PI3K/Akt-eNOS signaling pathway

1000- 4718(2017)04- 0608- 04

2017- 01- 03

2017- 02- 27

山东省自然科学基金资助项目(No. 2013WSB20008)

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.006

△通讯作者 Tel: 0531-82169216； E-mail: drlifuhai@126.com