液质联用测定芍药甘草汤中3种有效成分的含量*

徐 玉 石镇东 郑小伟

浙江中医药大学基础医学院 浙江 杭州 310053

中药研究

液质联用测定芍药甘草汤中3种有效成分的含量*

徐 玉 石镇东 郑小伟#

浙江中医药大学基础医学院 浙江 杭州 310053

目的：采用高效液相色谱联用三重四级杆质谱(HPLC-MS/MS)测定芍药甘草汤中芍药苷、甘草酸及甘草次酸三种成分的含量。方法：色谱柱采用Eclipse Plus C18(2.1mm×50mm，1.8mm)；流动相为0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水溶液，流速设定为0.3mL·min-1，柱温为35℃，进行梯度洗脱。根据待检测化合物的性质，优化相关定量分析的质谱参数，多重反应监测（MRM），进行数据的采集。结果：芍药甘草汤中芍药苷、甘草酸及甘草次酸的含量分别为：160.46±3.82mg·ml-1，115.66±3.13mg·ml-1，8.34±0.34mg·ml-1。结论：本实验精密性良好，重现性高，分析方法准确，定量数据可靠。

HPLC-MS/MS 芍药甘草汤 芍药苷 甘草酸 甘草次酸

芍药甘草汤是《伤寒论》中配伍严谨、药简效佳的经典方剂，为后世医家所推崇。本方仅由芍药、甘草两味中药组成，具有柔肝止痉、缓急止痛的功效[1]。对芍药甘草汤入血原型成分进行测定，发现芍药甘草汤的药效物质基础为芍药苷、甘草酸、甘草次酸[2]。本文采用高效液相色谱联用三重四级杆质谱(HPLC-MS/MS)同时测定芍药甘草汤中芍药苷、甘草酸和甘草次酸的含量，为芍药甘草汤药效物质研究提供理论基础。

1 实验仪器及材料

1.1 实验仪器：1290 HPLC-6460 QQQ/MS(Agilent，美国)；BS124S电子分析天平(赛利多斯科学仪器有限公司)；Milli-Q Biocel纯水仪(美国Millipore公司)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；RV10旋转蒸发仪(德国IKA公司)；Freezone 6L冷冻干燥机(英国Labconco公司)。

1.2 实验材料：甲酸（色谱级）购于阿拉丁公司；甲醇和乙腈（均为色谱级）均购于美国Tedia公司；白芍、炙甘草来自浙江中医药大学饮片厂；芍药苷、甘草酸和甘草次酸标准品均购于中国药品生物制品检定所。

2 实验方法

2.1 供试品制备：将白芍、炙甘草各12g，打碎后，加以500ml水侵泡1h，煎煮2h，重复煎煮2次，合并滤液，浓缩至150ml，－20℃保存备用。

2.2 对照品溶液配制：精密称取对照品芍药苷2.42mg、甘草酸1.97mg、甘草次酸2.36mg分别置于2ml容量瓶中，制成对照品母液；所得芍药苷浓度为1.21mg·ml-1，甘草酸0.985mg·ml-1，甘草次酸1.18mg·ml-1。

2.3 标准曲线绘制：精密吸取不同比例的对照品母液，混合得到对照品混合溶液，然后将对照品混合溶液定容至2ml，得到系列浓度对照品溶液，用于标准曲线绘制，所得对照品浓度见表1。

表1 对照品浓度(g·ml-1)

2.4 供试品前处理：取芍药甘草汤提取药液20ml，采用冷冻干燥后，残留物使用10ml色谱级甲醇超声溶解0.5h，溶液5000r·min-1×5min离心，取上清液使用0.22μm有机滤膜过滤，滤液可进行液质分析。

2.5 色谱质谱条件优化：经过对色谱条件的优化，最终确定的色谱条件：色谱柱为Eclipse Plus C18(2.1× 50mm，1.8mm)；柱温为35℃；流动相（A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈）；洗脱梯度（起始为5%B，保持1min，6min内增加至15%B，在11min内增加到22%B，在30min内升高到65%B，在32min内增加至95%B，保持1min，后运行时间设定为3min）；流速设定为0.3ml·min-1；进样量为5ml。质谱条件为：氮气干燥气流速为9L/min，温度设定为350℃，雾化气压力为3.1bar，毛细管电压设定为3500V。检测方式为多重反应监测（MRM），数据采集速率为2spectrum/s，优化后的质谱参数见表2。

表2 优化后的化合物质谱参数

3 方法学考察和结果

3.1 色谱质谱条件优化：使用乙腈-水二元系统，使用优化的梯度洗脱程序，良好分离了芍药甘草汤中复杂成分。质谱条件优化过程中，主要优化了干燥气流速，毛细管电泳，碎裂电压以及碰撞能等，对于离子相应有较大影响的质谱参数。以芍药苷为例说明优化程中，首先是使用全扫面(Scan)模式找到芍药苷离子峰[M+COOH]-：m/z 525.2，使用负离子选择离子检测(SIM)和子离子扫描(PS)优化m/z525.2的碎裂电压和碰撞能为120V和8eV；再分析子离子扫描得到的二级质谱结果(图1)，确定芍药苷的定量碎片离子m/z 449.2和m/z 121.0，并建立最终的多重反应检测(MRM)的定量方法。甘草酸和甘草次酸的质朴定量方法通过相同过程建立。

图1 芍药苷(A)、甘草酸(B)和甘草次酸(C)二级质谱图

3.2 标准曲线绘制：对照品按“2.3”方法处理，进样分析，所得标准曲线如表3，相关系数R2均大于0.997，表明标准曲线线性关系良好。

表3 线性方程结果，定量限和检测限

3.3 精密度、重复性及回收率实验：吸取一定浓度对照品，按“2.5”条件连续进样6次，测定3种对照品的浓度，分别计算相对标准偏差（RSD）。其结果均小于4%，表明方法稳定，精密度、重复性及准确度良好。见表4。

表4 有效成分定量结果

3.4 检测限和定量限：取已知浓度的标样溶液，按照“2.5”方法进样分析；以10倍信噪比为定量限，以3倍信噪比为检测限，得到定量限和检测限结果见表3。

3.5 样品含量测定：分别精密吸取芍药甘草汤供试品，按照“2.4”供试品处理方法处理，进样测定，平行进样3次。采用外标法计算芍药苷、甘草次酸及甘草酸的含量，结果见表4（n=3）。

4 结论

使用现代分析技术建立能被广泛接受的质量控制方法，可以使传统中药的应用变得有理有据[3]。本文采用HPLC/MS-MS同时测定芍药甘草汤中芍药苷、甘草酸和甘草次酸的含量。优化了毛细管电压、雾化器压力、干燥气温度和流速等离子源参数；使用全扫描找到目标化合物母离子，然后使用选择离子监测、自离子扫描分别优化了碎裂电压和碰撞能等质谱参数，建立了精密性良好、重现性高、准确的分析方法，定量测定了芍药甘草汤中芍药苷、甘草酸、甘草次酸的含量，这有助于芍药甘草汤的质量控制。

[1]高秀飞,胡婵娟,陈晓洁.芍药甘草汤加减治疗乳腺癌化疗期尿路感染疗效观察[J].浙江中医杂志,2013,48(3)：183.

[2]陈梅.芍药甘草汤入血成分的研究[D].南京：南京中医药大学,2010.

[3]周建良,齐炼文,李萍.色谱指纹图谱在中药质量控制中的应用[J].色谱,2008,26(2)：153-159.

2016-07-24

国家自然科学基金项目微小RNAs和长链非编码RNA对胃溃疡肝郁脾虚证线粒体低氧调控机制的研究，编号:81473596

# 通讯作者：郑小伟，E-mail：zhxw2103@163.com