双酚A及其类似物对斑马鱼成鱼及胚胎的急性毒性

任文娟,汪 贞,杨先海,刘济宁①,杨 倩,陈英文,沈树宝

(1.南京工业大学生物与制药工程学院,江苏 南京 211816;2.环境保护部南京环境科学研究所,江苏 南京 210042)

双酚A及其类似物对斑马鱼成鱼及胚胎的急性毒性

任文娟1,2,汪 贞2,杨先海2,刘济宁2①,杨 倩1,2,陈英文1②,沈树宝1

(1.南京工业大学生物与制药工程学院,江苏 南京 211816;2.环境保护部南京环境科学研究所,江苏 南京 210042)

双酚B(BPB)、双酚F(BPF)、双酚AP(BPAP)、双酚AF(BPAF)、双酚Z(BPZ)、双酚P(BPP)和双酚S(BPS)作为双酚A(BPA)的替代品被广泛使用,但其毒性数据非常有限。将BPA、BPB、BPF、BPZ、BPP、BPAP、BPAF和BPS暴露于斑马鱼成鱼及胚胎,通过24、48、72和96 h死亡率等指标比较8种化合物的急性毒性。结果显示,双酚A及其类似物对斑马鱼成鱼及胚胎毒性具有线性相关性。根据GB 30000.28—2013《化学品分类和标签规范 第28部分:对水生环境的危害》对受试物的急性水环境毒性的分级标准,判定BPP为毒性Ⅰ级,BPA、BPB、BPF、BPZ、BPAP和BPAF为毒性Ⅱ级,根据Verhaar分类方法,双酚A及其类似物属于麻醉致毒机制的化学品,其毒性大小与疏水基团相关。

双酚A及其类似物;急性毒性;半致死浓度(LC50);畸形

双酚A(bisphenol A,BPA)用于制造环氧树脂(epoxyresin)、聚碳酸酯(polycarbonate)以及精细化工产品(如农药、橡胶防老剂、婴儿奶瓶和瓶盖等)[1],是应用最广泛的工业化学品之一。研究表明,BPA具有干扰内分泌等毒性作用,对雄性生殖系统有一定的损害[2],可能会引起性早熟[3],对胚胎也会有一定的影响[4]。在低浓度长时间暴露的情况下,BPA对亲代和子代生殖系统、脑和神经系统及免疫系统等有不良影响,可能会引发癌症、肥胖、糖尿病、生殖障碍和神经系统紊乱等多种疾病。考虑到BPA的潜在低剂量效应,尤其是对婴幼儿等敏感人群[5-6],部分国家已经开始限制含BPA塑料制品的使用,近年来越来越多的国家采取了禁用措施。为了应对这些限制,一些双酚类似物如双酚B(bisphenol B,BPB)、双酚S(bisphenol S,BPS)和双酚F(bisphenol F,BPF)等被用来替代BPA用于环氧树脂、塑料、热敏纸和食品包装材料等的生产[7-9]。

常见的双酚A类似物有BPB、BPF、BPAP、BPAF、BPZ、BPP和BPS等,其CAS号及分子结构图如表1所示。双酚A类似物与双酚A具有相似的分子结构,都具有2个羟苯基,但2个羟苯基之间碳桥上的取代基不同,由于这类化合物具有性质较稳定、耐高温、延展性好、制作工艺简单和成本低等优点,因此被广泛用于工业生产[10-12]。FIEGE等[13]研究发现BPS是酚醛树脂和电镀溶剂等的组分,可增加物质的硬度和耐用度,已被用于道路和桥梁建设中。LIAO等[14]研究发现热敏纸中存在BPS。随着双酚A类似物的大量使用,污染物大量排入空气中,许多研究表明双酚A分子可以从婴儿奶瓶或瓶体脱离,进入水或食物中危害人体健康[15],并可与食物结合进入生物体[16],造成内分泌系统紊乱,而且具有易富集和不易降解等特点,因此对自然界生物体及人体带来越来越多的伤害[17]。

表1 双酚A及其类似物的基本信息

Table 1 Basic information of bisphenol A and its analogues

中文名称 CAS号 分子结构图双酚A80-05-7双酚B77-40-7双酚F620-92-8双酚AP1571-75-1双酚AF1478-61-1双酚Z843-55-0双酚P1100-88-5双酚S80-09-1

现阶段,对双酚A类似物已经有一些生物体效应方面的研究。SONG等[18]以斑马鱼的胚胎和幼鱼为模式生物研究了3种卤代双酚A化合物(TBBPA、TCBPA和BPAF)的发育毒性,半致死浓度值(LC50)的计算结果表明这几种物质的毒性由高到低为TCBPA、TBBPA和BPAF;KURUTO-NIWA等[19]将雄性和雌性斑马鱼暴露在BPS质量浓度为0.5～50 μg·L-1的水样中 21 d后,雌性和雄性斑马鱼血浆中的雌二醇含量显著升高,而雄性斑马鱼血浆中的睾酮含量则显著降低。李圆圆等[20]研究了BPA、BPS和BPF对黑斑蛙胚胎及蝌蚪的急性毒性,发现BPA的急性毒性与BPF相当,但高于BPS。虽然已有双酚A类似物对水生生物急性毒性的研究报道,但鲜见对几种检出率较高的双酚A类似物的系统研究,为了更好地说明8种双酚A及其类似物对生物的急性毒性效应,笔者采用模式生物斑马鱼及其胚胎来评价8种受试物对水生生物的潜在毒性效应,以期为双酚A类似物的生态风险评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 受试生物

试验所用斑马鱼(AB型)购于尧舜禹生物科技有限公司,平均体长(3.2±0.4) cm,平均体重0.15 g。斑马鱼胚胎购于尧舜禹生物科技有限公司,胚胎期斑马鱼暴露试验以囊胚期开端(即受精后2 h,2hpf)的胚胎作为起始。

1.1.2 试剂

BPA、BPB、BPF、BPAP、BPAF、BPZ、BPP和BPS购自百灵威科技有限公司(上海),以丙酮(色谱纯,德国 Merck公司)作溶剂配制成质量浓度为103～105mg·L-1的贮备液(置于4 ℃冰箱避光保存)。试验所有梯度稀释操作时均用丙酮作溶剂(丙酮体积分数为0.01%～0.5%),去离子水由Mini-Q 超纯水机制备(美国Miliipore公司)。

1.1.3 仪器设备

硬度计(16900型,美国哈希公司),多功能水质参数测定仪(HQ40d,美国哈希公司),溶解氧测定仪(HQ30d,美国哈希公司),电子分析天平(AG135,美国Mettler Toledo公司),生态培养箱(CLIMACELL型,德国MMM公司)。

1.2 试验方法

斑马鱼成鱼及胚胎急性毒性试验方法参照文献[21-22]进行。

1.2.1 受试物浓度设置

在正式试验之前先对8种物质进行较大范围浓度系列(0.1、1、10、100和1 000 mg·L-1)的预试验,先在玻璃缸中装入经曝气处理的水3 L,加入受试物贮备液,不设平行组,各试验容器放10尾斑马鱼,试验期间不换水、不喂食,观察记录鱼死亡数。

根据预试验得出的结果,斑马鱼成鱼及胚胎正式试验浓度梯度设置见表2。

表2 正式试验中双酚A及类似物的浓度设置

Table 2 Concentrations of bisphenol A and its analogues set in the formal test

受试物成鱼暴露质量浓度/(mg·L-1)胚胎暴露质量浓度/(mg·L-1) BPA1、2、4、6、8、10、12、140.05、0.25、1.25、2、4、6、8、10、12、14BPB1、2、4、6、8、100.05、0.25、1.25、2、4、6、8、10BPF1、2、4、6、8、10、12、140.05、0.25、1.25、2、4、6、8、10、12、14BPAP0.5、1、2、2.5、3、4、50.25、0.5、1、2、3、4BPAF1、2、2.5、3、4、5、60.25、0.5、1、2、3、4BPZ1、2、3、4、5、60.25、0.5、1、2、3、4BPP0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、10.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1BPS50、100、200、300、400、500150、200、250、300、350、400、450

1.2.2 水质参数测定

试验期间(0～96 h)试验用水硬度(以CaCO3计)为180～190 mg·L-1,pH值为7.0～7.2,溶解氧质量浓度为7.68～7.98 mg·L-1。

1.2.3 试验操作

将斑马鱼成鱼置于循环水玻璃缸中驯养2周,温度设置为(23±0.5) ℃,光照周期为t(光照)∶t(黑暗)=16 h∶8 h,每天投喂2次丰年虾(Artemiasalina),7 d内死亡率小于5%,可用于后续试验。

将斑马鱼成鱼随机放入含3 L药液的玻璃缸中,每个缸中放入10条已驯养斑马鱼,每个受试物浓度设3个平行,所有玻璃缸放到恒温水槽中,水槽温度设置为(23±0.5) ℃,光照周期为t(光照)∶t(黑暗)=16 h∶8 h。分别在6、24、48、54、72和96 h时记录斑马鱼死亡数,观察斑马鱼的异常行为,及时清除死鱼。

将斑马鱼受精卵放入50 mL小烧杯中,每个烧杯20粒,每个受试物浓度设3个平行,将烧杯置于生态培养箱,设定[光]照度为50 lx,光照周期为t(光照)∶t(黑暗)=16 h∶8 h,温度为(23±0.5) ℃。每天统计胚胎死亡数,用显微镜观察畸形情况,及时清除死亡胚胎。

1.3 统计学方法

采用美国环境保护局修正的斯皮尔曼-卡伯分析软件(Trimmed Spearman-Karber Method)计算LC50及95%置信区间,通过Origin 8.0软件拟合浓度-效应曲线。

2 试验结果

2.1 成年斑马鱼及胚胎的中毒现象

斑马鱼中毒时一般表现为侧翻、身体扭曲、串游和上浮等,死亡一段时间后沉入缸底。500 mg·L-1BPS试验组中,6 h内出现死亡现象;5、6 mg·L-1的 BPAF、BPZ和8、10 mg·L-1BPB试验组中,16 h内出现全部死亡现象;4、5 mg·L-1BPAP,12、14 mg·L-1BPA和14 mg·L-1BPF试验组中,24 h内出现全部死亡现象。1 mg·L-1BPP试验组中,30 h内出现全部死亡现象。

在高浓度暴露下早期阶段的受精卵颜色出现变化,由透明变成白色半透明并死亡。胚胎中毒后出现畸形或身体由半透明变为不透明并死亡。仔鱼中毒后出现畸形或无呼吸无心脏跳动死亡(图1)。

2.2 双酚A及类似物的毒性效应

表3是成鱼24、48、72和98 h的LC50及95%置信区间。图2是试验96 h时8种受试物暴露下成年斑马鱼的死亡率曲线图,对于同一种受试物,随着暴露浓度的升高死亡率也逐渐升高。8种受试物中BPP的死亡率首先达到100%,然后依次是BPAP、BPAF、BPB、BPA、BPF和BPS。

根据GB 30000.28—2013《化学品分类和标签规范 第28部分:对水生环境的危害》对受试物的急性水环境毒性的分级标准(96 h的LC50:≤1 mg·L-1为Ⅰ级,>1～10 mg·L-1为Ⅱ级,>10～100 mg·L-1为Ⅲ级)[23],结合图2和表3,判定BPP为毒性Ⅰ级,BPA、BPB、BPF、BPZ、BPAP和BPAF为毒性Ⅱ级。

图3是8种受试物暴露96 h时斑马鱼胚胎的死亡率曲线。随着受试物浓度升高,死亡率也逐渐升高,这与成鱼的试验结果一致。8种受试物比较而言,BPP的效应浓度最低,BPS的效应浓度最高,BPAF和BPAP对胚胎的浓度-效应曲线比较接近,说明它们对胚胎的急性毒性强度较接近,随后依次为BPZ、BPB、BPA和BPF。

表4是胚胎24、48、72和96 h的LC50及95%置信区间。结合图3和表4,判定BPP为毒性Ⅰ级,BPA、BPB、BPF、BPZ、BPAP和BPAF为毒性Ⅱ级。

a—6 h时发育正常的卵;b—6 h时的卵凝结;c—6 h时发育异常的卵;d—20 h时发育正常的卵;e—20 h时发育阻滞的胚胎;f—78 h时发育正常的胚胎;g—78 h时发育阻滞的胚胎;h—78 h时脊柱弯曲的胚胎;i、j、k、l—96 h时发育畸形的胚胎。ce—心包水肿;cv—卵黄囊肿;sc—脊柱弯曲;cf—颅面畸形。

表3 双酚A及其类似物对斑马鱼成鱼的半致死浓度(LC50)

Table 3 Half lethal concentration (LC50)of bisphenol A and its analogues for adult zebrafish

受试物ρ(LC50)/(mg·L-1)24h48h72h96hBPA9.51(8.96～10.08)9.31(8.85～9.80)8.09(7.21～9.08)8.09(7.21～9.08)BPB5.07(4.75～5.42)4.64(4.18～5.15)4.15(3.54～4.87)4.15(3.54～4.87)BPF10.10(9.37～10.81)9.86(9.19～10.6)9.51(8.96～10.10)9.51(8.96～10.10)BPAP3.04(2.78～3.32)2.70(2.48～2.94)2.42(2.28～2.58)2.28(2.00～2.37)BPAF3.15(2.93～3.39)2.64(2.45～2.84)2.47(2.32～2.64)2.47(2.32～2.64)BPZ3.43(3.16～3.72)2.72(2.46～3.01)2.63(2.40～2.87)2.63(2.40～2.87)BPP0.70(0.60～0.83)0.46(0.38～0.45)0.40(0.33～0.48)BPS343(316～372)343(316～372)343(316～372)343(316～372)

括号内数据为95%置信限。

暴露时间为96 h。

暴露时间为96 h。

表4 双酚A及类似物对斑马鱼胚胎的半致死浓度(LC50)

Table 4 Half lethal concentration (LC50)of bisphenol A and its analogues for zebrafish embryo

受试物ρ(LC50)/(mg·L-1)24h 48h 72h 96h BPA8.04(6.95～9.31)7.85(6.78～9.09)7.74(6.68～8.98)5.82(4.61～7.36)BPB7.18(6.45～8.00)6.54(5.77～7.42)4.53(3.58～5.72)3.88(3.06～4.91)BPF9.13(8.29～10.10)8.93(8.11～9.48)8.56(7.80～9.39)7.40(6.61～8.29)BPAP2.84(2.59～3.12)2.61(2.33～2.93)2.57(2.29～2.89)2.29(2.02～2.61)BPAF3.89(3.34～4.54)3.49(3.20～3.81)2.04(1.77～2.36)BPZ3.39(3.02～3.80)3.25(2.88～3.67)2.98(2.67～3.34)BPP0.81(0.77～0.85)0.66(0.62～0.70)0.40(0.36～0.44)0.37(0.34～0.41)BPS361(350～372)346(331～361)331(317～346)323(308～339)

括号内数据为95%置信限。

斑马鱼成鱼和胚胎96 h时的LC50对比如图4所示。从图4可知,8种受试物对成鱼和胚胎的LC50相差不大。斑马鱼成鱼(x)和胚胎(y)的毒性相关性见图5,24 h时毒性回归方程为y=-0.476+1.052x,R2为0.999 89;48 h时毒性回归方程为y=0.164+1.004x,R2为0.999 9;72 h时毒性回归方程为y=0.274+0.963 3x,R2为0.999 98;96 h时毒性回归方程为y=-0.430 96+0.942 89x,R2为0.999 94。由图5可以看出,当某种受试物对成年斑马鱼的LC50高时,则该受试物对胚胎的LC50也较高,说明双酚A及其类似物对斑马鱼成鱼与胚胎的毒性效应有高度的一致性。

图4 斑马鱼成鱼和胚胎96 h时的半致死浓度(LC50)Fig.4 96 h LC50 of bisphenol A and its analogues for adult zebrafish and embryo

y—胚胎ρ(LC50)；x—成鱼ρ(LC50)。

3 讨论

双酚A是被研究较多的环境内分泌干扰物,关于双酚A及其类似物的毒性比较研究较少,该试验对BPA及其7种类似物BPB、BPF、BPAP、BPAF、BPZ、BPP、BPS进行了比较研究,发现BPP对斑马鱼成鱼及胚胎的毒性最大,BPS毒性最小,根据GB 30000.28—2013对受试物的急性水环境毒性的分级标准[23],判定BPP为毒性Ⅰ级,BPA、BPB、BPF、BPZ、BPAP和BPAF为毒性Ⅱ级。

根据Verhaar分类方法,具有麻醉致毒机制的化合物,其毒性与化合物的辛醇-水分配系数KOW(lgKOW值由EPI Suit 4.1软件计算)具有较好相关性。图6显示了8种受试物的KOW与96 h的LC50的线性关系,可以看出两者拟合度较好,说明这些受试物的毒性与本身的疏水性密切相关。它们具有相似的分子结构,都具有2个羟苯基,但2个羟苯基之间碳桥上的取代基不同,取代基的疏水性大小决定了其毒性大小,疏水性越大毒性越大。例如BPA的碳桥上连了2个甲基,而BPP比BPA多2个甲基和1个苯环,所以BPP的疏水性大,毒性大于BPA。BPA比BPF多2个甲基,所以BPA的疏水性大,毒性大于BPF。BPS的碳桥被硫氧基取代,所以疏水性变小,毒性比BPA小。综上可知,8种双酚A及其类似物是具有麻醉致毒机制的化合物。

y—-lg ρ(LC50)；x—lg Kow。

这些双酚类有毒物质在水体中被广泛检出,GONG等[24]测得珠江水ρ(BPA)为0.04～0.64 μg·L-1。WU等[25]测得黄浦江ρ(BPA)平均值为22.93 ng·L-1。YANG等[26]对浙江杭州湾嘉兴段BPAF生产区的河水研究发现,除了ρ(BPAF)较高(254.59 ng·L-1)以外,还检测出了不同浓度的BPS、BPF和BPA;SONG等[27]对BPAF制造厂周围不同环境介质的分析发现,大部分环境介质中均检测到不同浓度的BPAF,其中,河水中质量浓度为<最低检测限(LOD)～1.53×104ng·L-1,虽然在水环境中的检出量小于效应值,但由于双酚A及其类似物很难降解,会在水生生物体内不断积累,造成长期影响,所以仍需持续关注。

鱼类对污染物的暴露特别敏感,有较多的毒性研究试验都以成年斑马鱼或稀有鮈鲫作为模式生物,以胚胎作为受试生物的研究较少,通过毒性相关性分析得知成鱼和胚胎毒性效应呈线性相关关系,因此传统的成鱼毒性试验可以被胚胎毒性试验所代替,鱼类胚胎毒性测试可用于化学品的急性毒性研究。

4 结论

(1) 通过对斑马鱼成鱼及胚胎96 h的急性毒性试验,发现BPS的毒性比BPA、BPB、BPF、BPAP、BPAF和BPZ低2个数量级,比BPP毒性低3个数量级。BPP对斑马鱼成鱼及胚胎的的毒性效应最大,需要加强防范。

(2) 根据GB 30000.28—2013对受试物的急性水环境毒性的分级标准,判定BPP为毒性Ⅰ级,BPA、BPB、BPF、BPZ、BPAP和BPAF为毒性Ⅱ级;双酚A及其类似物是具有麻醉致毒机制的化合物,其毒性大小与疏水性密切相关,疏水性越大毒性越大。

(3) 双酚A及其类似物对斑马鱼成鱼与胚胎的毒性效应有一致性。

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(责任编辑： 许 素)

Acute Toxicity Effect of Bisphenol A and Its Analogues on Adult and Embryo of Zebrafish.

RENWen-juan1,2,WANGZhen2,YANGXian-hai2,LIUJi-ning2,YANGQian1,2,CHENYing-wen1,SHENShu-bao1

(1.School of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering， Nanjing Tech University, Nanjing 211816, China;2.Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China)

Little is known so far about toxicities of bisphenol B(BPB), bisphenol F(BPF), bisphenol AP(BPAP), bisphenol AF(BPAF), bisphenol Z(BPZ), bisphenol P(BPP), bisphenol S (BPS), although they have been used widely as BPA substitutes. A comparative study was done by exposing adults and embryos of zebrafish to the 8 kinds of chemicals for 24, 48, 72 and 96 hours to determine half lethal concentration (LC50) and fatality rate at different time intervals. Results show that the toxicities of bisphenol A and its analogues to adult zebrafish were linearly related to their respective ones to zebrafish embryos. According to the criteria for grading of toxicity in “Rules for Classification and Labeling of Chemicals, Part 28：Hazardous to the Aquatic Environment”, BPP is sorted into Grade Ⅰ in toxicity and BPA, BPB, BPF, BPZ, BPAP and BPAF into Grade Ⅱ, while according to the Verhaar classification system, bisphenol A and its analogues belong to the category of chemicals with anesthetic toxication mechanism and degree of their toxicities is related to hydrophobic groups.

bisphenol A and its analogue; acute toxicity; median lethal concentration (LC50); deformity

2016-05-24

江苏省自然科学基金(BK20151100)

X592

A

1673-4831(2017)04-0372-07

10.11934/j.issn.1673-4831.2017.04.011

任文娟(1989—)，女，山东荷泽人，硕士生，主要从事化学品生态毒理学研究。E-mail: rwj123123@126.com

① 通信作者E-mail: ljn@nies.org

② 共同通信作者E-mail: ywchen@njtech.edu.cn