PRM1基因C321A、G197T单核苷酸多态性对体外受精结局的影响

李伟伟，闫娅妮，史鸿志，董丽霞，殷秀荣

(秦皇岛市妇幼保健院生殖医学科，秦皇岛 066004)

PRM1基因C321A、G197T单核苷酸多态性对体外受精结局的影响

李伟伟，闫娅妮，史鸿志，董丽霞，殷秀荣*

(秦皇岛市妇幼保健院生殖医学科，秦皇岛 066004)

目的 探讨鱼精蛋白1的C321A、G197T基因多态性与体外受精结局的关系。 方法 选取我院生殖中心进行常规IVF的182例(182个周期)，根据受精率分为3组：A组受精率<30%，43个周期；B组受精率在30%～65%之间，24个周期；C组受精率>65%，115个周期。提取授精后剩余精子的基因组DNA，采用聚合酶链限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测PRM1基因C321A和G197T 基因型频率和分布，比较3组间基因型的分布差异及所有研究对象不同基因型间受精率的差异。 结果 3组间比较，PRM1基因C321A多态性位点的各基因型频率无显著性差异(P>0.05)，C321A多态性位点与IVF受精率无相关性(P>0.05)。在A组中，PRM1基因 G197T多态性位点GG、GT、TT基因型分布频率分别为9.3%(4)、25.6%(11)、65.1%(28)；B组分别为8.3%(2)、25.0%(6)、66.7%(16)；C组分别为38.3%(44)、26.1%(30)、35.6%(41)。A组和B组的TT基因型频率显著高于C组(65.1% vs. 35.6%，66.7% vs. 35.6%)，差异均有统计学意义(P<0.05)，TT基因型增加了IVF受精失败的风险。 结论 PRM1基因 C321A多态性与IVF受精率不相关；PRM1基因 G197T多态性改变与IVF受精率相关。

鱼精蛋白1； 单核苷酸多态性； 体外受精

(JReprodMed2017，26(4)：362-365)

全世界大约15%的夫妇受到不孕不育的困扰，尽管辅助生殖技术能够解决一部分男性患者的不育情况，但是仍有部分男性不育的问题未得到解决。近来有研究表明鱼精蛋白(PRM)与男性不育显著相关[1-2]。PRM在精子核中是主要的DNA结合蛋白，分为PRM1和PRM2，其在精子生成及受精等方面的功能越来越受到学者的重视。越来越多的学者从遗传角度上对男性不育的原因进行分析，主要的遗传异常包括：染色体畸变、染色体微缺失、单基因突变和遗传多态性等[3]。单核苷酸多态性(SNP)是目前分布最广泛且存在数量最多的一种遗传多态性。PRM1基因SNP的研究热点主要是rs35576928、rs737008和rs2301365这3个位点[4]。目前国内针对PRM1基因多态性与体外受精结局的研究尚不多，本文通过研究PRM1基因的C321A和G197T多态性与体外受精(IVF)结局的相关性，在基因多态性的水平上探讨受精失败的原因。

资料与方法

一、研究对象与分组

选取我院生殖中心2015年5月至2016年10月进行常规IVF的182例(182个周期)，纳入标准：女方单纯输卵管性不孕，年龄24～37岁，男方年龄25～40岁，双方染色体均正常，首次IVF。纳入标准：近3个月内未使用过激素类药物，既往无自然流产史，患者身体健康，无遗传性疾病家族史，近期无泌尿生殖系统感染，基础内分泌水平正常。该研究经本院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

根据受精率将182个IVF周期分3组，A组43周期，受精率<30%；B组24周期，30%≤受精率≤65%；C组115 周期，受精率>65%。

二、研究方法

1.精子制备和DNA提取：取卵日，采用密度梯度结合上游法处理精液，将授精剩余的精子进行DNA的提取。采用常规苯酚-氯仿法进行基因组DNA 提取，并对DNA含量进行分析、测定，-80 ℃保存，备用。

2.引物设计与合成：登陆Gen Bank 查询PRM1基因全序列M60331，引物设计采用primer 5.0软件完成，根据PRM1基因序列，C321A上游引物5’-cccctggcatctataacaggccgc-3，下游引物5’-tcaagaacaaggagagaagagtgg-3’，扩增片段为557 bp。G197T上游引物：5’-ttctcacagcccacagagtt-3’，下游引物：5’-ggcaacatttattgacaggcgg-3’，扩增片段为398 bp，引物合成由大连宝生物公司完成。

3.PCR产物扩增：应用 DNA作为模板，建立25 μl聚合酶链反应(PCR)体系，模板DNA 1 μl，d NTPs 1 μl，10× PCR Buffer 2.5 μl，PRM1基因5’引物0.5 μl，PRM1基因3’引物 0.5 μl，Taq酶0.5 μl，加去离子水至终体积25 μl。PCR反应条件，94℃预变性2 min，94℃变性50 s，60℃退火50 s，72℃延伸50 s，共35个循环，最后72℃延伸10 min，降至4℃保温。PCR产物均用1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

4.聚合酶链限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析及电泳检测：BstuI和BseR I分别酶切557 bp和398 bp PCR产物，BstuI酶切反应体系为15 μl，其中扩增产物为10 μl，限制性内切酶为5 U，37℃恒温过夜；Bse R I酶切体系为12 μl，其中扩增产物为6 μl，限制性内切酶1 μl，37℃恒温过夜。酶切产物分别用1.5%和2%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

三、统计学分析

采用 SPSS 13.0统计软件进行数据分析，χ2检验用来检测 SNP 位点在检测人群中的分布是否符合哈迪-温伯格定律并检测基因型在各组中的分布频率，单因素方差分析用于比较不同基因型对受精率的影响，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、PCR-RLPF检测结果

PRM1基因C321A多态性PCR产物长度为557 bp，经BstuI酶切后，1.5%琼脂糖凝胶电泳，基因型结果显示见图1。PRM1基因G197T多态性PCR产物长度为398 bp，2%琼脂糖凝胶电泳，基因型结果显示见图2。

1：1 000 bp marker；2：PRM1 DNA；3：CC基因型；4：CA基因型；5：AA 基因型图1 BstuI酶切557 bp PCR产物结果1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果

1：2 000 bp marker；2：GG基因型；3：GT基因型；4：TT 基因型；5：PRM1 DNA图2 BseRI酶切 398 bp PCR产物结果2%琼脂糖凝胶电泳检测结果

二、PRM1基因C321A多态性位点的基因型分析

所有研究对象均符合哈迪-温伯格平衡定律。A组中CC、CA、AA基因型样本例数分别为13、11、19例，B组中CC、CA、AA基因型样本例数分别为7、6、11例；C组中CC、CA、AA基因型样本例数分别为31、33、51例；3组间比较，基因型CA、AA及CA+AA分布无显著性差异(P>0.05)(表1)。

三、PRM1基因G197T多态性位点的基因型分析

在A组中GG、GT和TT基因型样本例数分别为4、11、28例；在B组中GG、GT和TT基因型样本例数分别为2、6、16例；在C组中GG、GT和TT基因型样本例数分别为 44、30、41；A组和B组TT基因型及GT+TT基因型分布频率显著高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)。GT基因型在3组间的分布无统计学差异(P>0.05)(表2)。

表1 PRM1基因C321A位点的基因型在3组间的分布频率

表2 PRM1基因G197T位点的基因型在3组间的分布频率

注：与C组比较，▲P<0.05

四、PRM1基因C321A、G197T多态性位点对受精率的影响

C321A多态性位点不同基因型间受精率无显著性差异(P>0.05)；G197T多态性位点不同基因型间受精率有显著性差异(P<0.05)，TT基因型受精率低于GT和GG基因型，差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。

表3 PRM1基因 C321A、G197T多态性位点不同基因型对IVF受精率的影响(x-±s)

注：与GT和GG基因型比较，★P<0.05

讨 论

目前，人们对SNPs的研究越来越广泛，涉及到各种多基因疾病和一些复杂性疾病。近年来，更多学者专注于男性不育与相关基因SNPs关联性的研究[5-6]，研究结果发现一些基因的SNP与男性不育存在一定的相关性，它们可能参与细胞增殖和抗氧化过程，与精子发生过程相关。但这些研究主要见于国外，国内相关报道尚少。IVF-ET是治疗不孕的最有效方法，即使ICSI技术日趋成熟，仍有部分精液分析正常的男性无法在IVF中使卵母细胞受精，甚至ICSI也可能出现卵母细胞不受精的现象，所以研究精卵受精失败具有重要意义。

PRM是人精子细胞核中含量最丰富的核蛋白，在精子发生和DNA凝聚过程中，睾丸生精细胞内核蛋白组型由组蛋白转化为PRM。PRM根据其氨基酸的组成和序列分为两类，PRM1和 PRM2。PRM促使精子中的核基质与核蛋白之间的结合更紧密，从而使核内染色质高度富集浓缩，防止精子基因组因内部或外部因素而诱发突变[7-8]。国外学者Iguchi等[9]发现并报道PRM1上第一个SNP位点是c.197G>T。该位点破坏PRM1与DNA结合所必须的高度保守的富含精氨酸区域，从而影响精子的发生障碍，进一步影响受精。关于PRM基因多态性与受精率和胚胎发育的研究国内报道较少，鱼精蛋白影响受精率和胚胎发育的机制有待进一步研究。本文针对PRM1基因C321A和G197T多态性位点与IVF受精结局之间的相关性展开研究，从基因多态性的水平上研究PRM1基因多态性与受精率的相关性。结果表明PRM1基因C321A多态性位点与IVF受精率之间不相关；PRM1基因G197T多态性位点TT基因型显著增加了受精失败的风险，与IVF的受精率相关。

余庆峰等[10]报道PRM1基因SNP位点-190C->A多态性可能与中国汉族畸形精子症男性不育存在相关，该位点可能导致精子形态异常。近期，一项小样本GWAS(genome-wide analysis study)研究[11]报道了PRM1基因和PRM2基因3个标签SNPs(rs2301365、rs35576928和rs3177008)与非梗阻性无精子症和严重少弱精子症有关。李俊等[12]研究结果表明，PRM1基因SNP位点C321A与男性不育具有相关性，而Tanaka等[13]和Siasi等[11]均报道PRM1基因C321位点多态性与男性不育不存在相关性，国内外报道存在争议。本研究选取C321 snp位点进行研究，探讨此位点多态性与IVF受精率的相关性，结果表明C321多态性位点与IVF受精结局之间不存在相关性，与Tanaka和Siasi的研究相一致。lguchi 等[9]曾首次提出PRM1基因G197T多态性位点与男性不育可能相关，本研究结果表明G197T位点多态性是受精失败的风险，更进一步证实其与男性不育的相关性。

本研究选取首次IVF的182个周期的患者作为研究对象，结果表明PRM1基因G197T snp位点 TT基因型是IVF受精失败的风险因素，但是由于研究病例有限，仍需要扩大样本量进一步验证。尽管目前已知此位点是风险因素，但是其具体机制尚不清楚，进一步研究其导致受精失败的机制变得十分重要，为临床提供更多的治疗方案，改善或者避免受精失败的发生。

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[2] Jiang W，Sun H，Zhang J，et al. Polymorphisms in protamine 1and protamine 2 predict the risk of male infertility：a meta-analysis[J]. Sci Rep，2015，5：15300.

[3] 杨洋，王树玉. 男性不育影响因素的研究进展[J]. 中国优生与遗传杂志，2011，19，131-132.

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[8] 王旭初，李海松，潘天明. 精核蛋白与男性不育研究进展[J].生殖医学杂志，2006，15：285-288.

[9] Iguchi N，Yang S，Lamb DJ，et al. An SNP in protamine 1：a possible genetic cause of male infertility? [J]. J Med Genet，2006，43：382-384.

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[11] Siasi E，Aleyasin A，Mowla J，et al. Association study of six SNPs in PRM1，PRM2 and TNP2 genes in iranian infertile men with idiopathic azoospermia[J]. Iran J Reprod Med，2012，10：329-336.

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[编辑：侯丽]

Association between C321A & G197T polymorphism of PRM1 gene and IVF fertilization rate

LIWei-wei，YANYa-ni，SHIHong-zhi，DONGLi-xia，YINXiu-rong*

Departmentofreproductivemedicine，MaternityandchildcarecenterofQinhuangdao，Qinhuangdao066004

Objective：To explore the association between single nucleotide polymorphism (SNP) loci C321A & G197T in protamine 1 (PRM1) gene and IVF fertilization rate.Methods：A total of 182 IVF-ET cycles in our reproductive center were collected. The cycles were divided into three groups by the fertilization rate：the cycles with fertilization rate<30% in group A (n=43)，30% to 65% in group B (n=24) cycles，and>65% in group C (n=115). The genomic DNA of residual sperm after insemination was extracted，and the frequency of C321A and G197T in PRM1 was detected by PCR-RFLP analysis. The differences in genotype and IVF fertilization rate were compared among the three groups.Results：There was no any significant difference in the genotype frequency of C321 polymorphism in PRM1 gene among the three groups(P>0.05). C321A polymorphism in PRM1 gene was not associated with IVF fertilization rate(P>0.05). The frequency of genotype GG，GT and TT of G197T in PRM1 gene was 9.3%(4)，25.6%(11)，and 65.1%(28)in group A；the frequency of genotype GG，GT and TT was 8.3%(2)，25.0%(6)，and 66.7%(16)in group B；and the frequency of genotype GG，GT and TT was 38.3%(44)，26.1%(30)，and 35.6%(41)in group C respectively. The frequency of genotype TT of G197T in group A and group B was significantly higher than that of group C(65.1% vs. 35.6%，66.7% vs. 35.6%)(P<0.05). Genotype TT of PRM1 G197T increased the risk of fertilization failure.Conclusions：The SNP of C321A in PRM1 is not associated with IVF fertilization rate. The SNP of G197T in PRM1 is associated with IVF fertilization rate.

Protamine 1； Single nucleotide polymorphism； IVF

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.04.014

2016-11-06；

2016-12-03

李伟伟，女，河北秦皇岛人，硕士研究生，主管检验师，生殖医学专业.(*

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