AIH治疗失败后行IVF-ET患者卵泡液中抗精子抗体和抗心磷脂抗体表达情况及妊娠结局

徐楗荧，赵雪燕，王磊，杨嫦玉，蔡桂丰

(珠海市妇幼保健院生殖中心，珠海 519000)

AIH治疗失败后行IVF-ET患者卵泡液中抗精子抗体和抗心磷脂抗体表达情况及妊娠结局

徐楗荧*，赵雪燕，王磊，杨嫦玉，蔡桂丰

(珠海市妇幼保健院生殖中心，珠海 519000)

目的 探讨夫精人工授精(AIH)治疗失败后行IVF-ET患者，卵泡液中抗精子抗体(AsAb)和抗心磷脂抗体(AcAb)表达情况及妊娠结局。 方法 回顾性分析2014年1月～10月在我院生殖中心AIH≥3次失败后行IVF-ET的79个周期，其中30个周期行IVF-ET后无优质胚胎移植或未妊娠者纳入A组，49个周期行IVF-ET后成功妊娠者作为对照B组，比较两组临床资料、获卵、受精及优质胚胎情况；应用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测两组卵泡液中AsAb和AcAb的表达。 结果 两组年龄、不孕年限、体重指数(BMI)、激素等临床资料比较，差异均无统计学意义 (P>0.05)。A组受精率和优质胚胎数显著低于B组 (P<0.01)；A组平均获卵数和卵裂率低于B组，但差异无统计学意义 (P>0.05)。卵泡液中AsAb和AcAb在A组阳性率均显著高于B组(P<0.01)。 结论 AIH≥3次未妊娠后行IVF-ET卵泡液中AsAb和AcAb阳性表达，可能影响受精、优质胚胎形成和胚胎种植生殖环节。

夫精人工授精； 体外受精-胚胎移植； 抗精子抗体； 抗心磷脂抗体； 妊娠结局

(JReprodMed2017，26(4)：341-344)

不孕的病因和机制非常复杂，近年来有关免疫与不孕的关系已引起研究学者的高度重视，并成为生殖医学研究的热点[1]。免疫因子抗精子抗体(antisperm antibodies，AsAb)和抗心磷脂抗体(anticardiolipin antibodies，AcAb)与不孕及流产关系密切，目前较多临床研究提示血液和宫颈粘液中AsAb和AcAb阳性表达导致不孕和孕早期流产[2-6]。但是，卵泡液中AsAb和AcAb表达情况及与不孕的关系国内外少见报道。本研究回顾性分析反复夫精人工授精(AIH)治疗失败后行IVF-ET患者79个周期，探讨免疫因子AsAb和AcAb表达情况及妊娠结局。

资料与方法

一、研究对象及分组

回顾性分析2014年1月～10月在我院生殖中心行IVF-ET的79个周期。纳入标准：(1)既往行AIH≥3次失败；(2)超声检查未发现卵巢囊肿或者行腹腔镜检查排除子宫内膜异位症(EMs)及盆腔粘连；(3)无生殖道及子宫器质性疾病，宫腔无病变；(4)既往无家族性特殊病种史，无免疫系统疾病、血液病、血栓性疾病及其他系统疾病史。其中30个周期行IVF-ET后无优质胚胎移植或未妊娠者纳入A组，包括继发不孕9个周期，原发不孕21个周期；49个周期行IVF-ET后成功妊娠者作为对照组(B组)，包括继发不孕20个周期，原发不孕29个周期。根据男方取卵当天取出精子的情况决定受精方式，A组25个周期行常规IVF，5个周期行卵母细胞浆单精子注射(ICSI)；B组45个周期行常规IVF，4个周期行ICSI。病因包括输卵管因素、多囊卵巢综合征、排卵障碍、男方少、弱、畸形精子症等。

二、研究方法

1. 控制性促排卵方案：应用长效促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a，博福—益普生，法国)长方案降调节，月经第3天后给予重组卵泡刺激素(rFSH，默克雪兰诺，德国)和/或尿人绝经期促性腺激素(HMG，广州丽珠)进行控制性促排卵，根据患者情况及卵泡长势调整剂量。两组患者均于用药期间行阴道超声监测卵泡发育，并测定血清LH、E2及孕酮(P)水平。当至少有1个主导卵泡直径≥18 mm或者2个主导卵泡直径≥17 mm时，皮下注射重组人绒毛膜促性腺激素(艾泽，默克雪兰诺，德国)250 μg。

2.取卵及移植：注射重组人绒毛膜促性腺激素后34～36 h阴道超声引导下行取卵术。卵母细胞培养3～6 h后行IVF或者ICSI，受精16～20 h观察受精卵原核形成情况，孵箱中继续培养，定期观察胚胎卵裂情况，取卵后第3天对胚胎进行分级并行胚胎移植。

3. 胚胎分级[7]：根据卵裂速度、碎片量、卵裂球形态及均匀度等情况，将胚胎分为四级。A级：胚胎卵裂球呈圆或卵圆形，大小均匀，形态规则，胞质均匀清晰，透明带完整，无碎片或碎片<5%；B级：卵裂球形状略不规则，大小略不同，胞质可有颗粒现象，碎片6%～20%；C级：卵裂球大小明显不均，可有明显形态不规则，胞质可有颗粒现象，碎片21%～50%，透明带完整；D级：卵裂球大小严重不均，胞质可有严重颗粒现象，碎片>50%。A级和B级胚胎定为优质胚胎。

4. 妊娠结局判定：所有患者均于取卵后每天肌注60 mg黄体酮注射液 (湖北制药)行黄体支持。胚胎移植后第14天测定血清中HCG水平，>50 U/L 者为生化妊娠，继续黄体支持。移植后第28～35天行阴道超声检查见到胎芽及胎心血管搏动者为临床妊娠。

5. 标本取材：行阴道超声引导下取卵术时负压抽吸卵泡液10～20 ml，避免血液污染，收集淡黄色卵泡液到无菌管中。室温静置10～15 min，每份标本分装两个无菌管置于-20℃冰箱备用，用于ELISA实验。

6. ELISA法检测AsAb和AcAb表达情况：ELISA试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司，用于检测人卵泡液中AsAb和AcAb蛋白表达，具体操作按试剂盒说明书进行。应用酶标仪(iMark型，BIO-RAD公司，美国)以450 nm波长依序测量各孔的吸光度(optical density，OD值)，每个标本同批次均设3个复孔，计算OD平均值。P/N=标本平均OD值/阴性对照OD值，P/N≥2.1为阳性，P/N<2.1为阴性，阴性对照小于0.10时以0.10计算。

7.观察指标：比较两组患者年龄、不孕年限、体重指数(BMI)、基础性激素、启动日及HCG性激素水平，获卵及受精情况，妊娠结局情况，卵泡液中AsAb和AcAb表达情况比较。

三、统计学分析

应用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析。计量资料数据以均数±标准差(±s)表示，两组间比较应用t检验；计数资料用百分率表示，两组间比较应用χ2检验。检验标准取双侧α=0.05，P<0.05认为差异有统计学意义。

结 果

一、两组一般情况比较

两组患者年龄、不孕年限、体重指数(BMI)、基础FSH、基础LH、基础T、启动日FSH、LH及HCG日LH、E2相比较，差异均无统计学意义 (P>0.05) (表1)。

二、两组获卵及受精情况比较

A组的受精率低于B组，差异有显著性意义(P<0.01)；A组的平均获卵数和卵裂率均低于B组，但差异无统计学差异 (P>0.05)。A组中9个周期因移植日无优质胚胎未行移植，其中6个周期因无正常受精而无优质胚胎，优质胚胎数显著低于B组(P<0.01) (表2)。

三、两组妊娠结局情况

A组患者行ET均未妊娠，其中5个周期因移植日卵巢过度刺激综合征(OHSS)高风险、孕酮升高等因素取消新鲜胚胎移植，后行FET未妊娠。B组中10个周期因上述因素未行新鲜胚胎移植，后行FET成功妊娠；2个周期为新鲜胚胎移植周期未成功，后行FET成功妊娠。B组3个周期孕早期流产(占6.12%)，2个周期宫外孕。

四、两组卵泡液中AsAb和AcAb表达情况比较

两组卵泡液中AsAb和AcAb表达情况比较，A组的AsAb和AcAb 阳性率均高于B组，比较有显著性差异(P<0.01) (表3)。

表1 两组一般情况比较(x-±s)

表2 两组获卵及受精情况比较 [(x-±s)，%]

注：与A组比较，*P<0.01

讨 论

生殖免疫学是近年来发展极快的新兴学科，从免疫学的角度研究生殖过程的各个环节，并为生殖医学开拓新的诊断和防治途径。随着生殖免疫学的发展，研究学者发现患者机体免疫系统产生针对自身抗原的某些抗体导致不孕。免疫性不孕发病率波动于5%～79%，血液中及卵泡液中存在各种抗体引起免疫紊乱，导致精子与卵母细胞受精、配子形成、胚胎发育及着床等各个环节发生障碍，可能是引起不孕的原因[8-10]。

在免疫性不孕中，最常见的是AsAb所导致的生殖障碍[11]。抗精子抗体主要生物学效应[12]：妨碍精子正常发生；干扰精子获能和顶体反应；引起精子凝集与制动；发挥细胞毒性作用；抑制精子穿透宫颈粘液；限制精子与卵母细胞粘附；阻止精子与卵母细胞结合并干扰受精过程；干扰胚胎着床并影响胚胎存活。精子获能过程涉及精子膜蛋白磷酸化和脂质再分布。顶体反应是精子膜与外顶体膜融合，使顶体素和透明质酸酶等顶体内容物暴露的胞吐过程。卵泡液中AsAb能够阻止精子与透明带结合，抑制顶体反应[13]。但是，血液及卵泡液中AsAb是否与IVF-ET妊娠结局有关尚存在争议[14]。本研究通过检测反复AIH失败患者行IVF-ET后卵泡液中AsAb表达情况，提示AsAb阳性表达的患者受精率和优质胚胎率均降低。受精过程涉及精子与卵丘细胞的相互作用、精子与卵透明带的初级结合、次级结合以及精子与卵细胞膜的结合。顶体透明质酸酶能分解卵丘的基质，促进精子穿透卵丘，同时能增加精子Ca2+，使精子对其后卵透明带诱发的顶体反应更敏感。精子与透明带的结合涉及特异性蛋白或糖的相互作用。抗精子抗体能阻断上述过程，从而影响受精。

表3 两组卵泡液中AsAb和AcAb表达情况比较(%)

注：与A组比较，*P<0.01

自身免疫是指机体免疫系统产生针对自身抗原和(或)自身致敏性淋巴细胞所产生的免疫反应。如果自身抗体或自身致敏性淋巴细胞攻击自身组织、细胞导致其产生病理改变和功能障碍时即为病理性自身免疫。抗磷脂抗体是一组针对各种带有负电荷的磷脂及其结合蛋白成分而产生的自身免疫抗体，主要有AcAb。AcAb通过抑制细胞滋养细胞分化为合体滋养细胞使胎盘β-HCG合成和分泌减少，抑制滋养细胞增殖，减弱滋养细胞侵蚀能力，干扰子宫螺旋动脉血管重铸等方面影响胚胎着床及种植。有研究显示，AcAb抗体阳性者其IVF-ET周期妊娠率及胚胎种植率下降[15]。本研究显示，反复AIH失败患者行IVF-ET后，无优质胚胎移植或未妊娠者卵泡液中AcAb抗体阳性率为36.7%，行ET或者FET成功妊娠者卵泡液中AcAb抗体阳性率为10.2%。无优质胚胎移植或未妊娠者卵泡液中AcAb抗体阳性率显著高于成功妊娠者，比较有显著性差异(P<0.01)。反复AIH失败患者行IVF-ET卵泡液中AsAb和AcAb阳性表达，可能影响受精、优质胚胎形成和胚胎种植生殖环节。

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[编辑：郭永]

Relationship between pregnancy outcome and expression of AsAb and AcAb in follicular fluid in IVF-ET patient after AIH failure

XUJian-Ying*，ZHAOXue-Yan，WANGLei，YANGChang-Yu，CAIGui-Feng

ZhuhaiMaternalandChildren’sHospitalandHealthInstitute，Zhuhai519000

Objective：To investigate the relationship between pregnancy outcome and the expression of antisperm antibodies (AsAb)and anticardiolipin antibodies (AcAb) in follicular fluid in the IVF-ET patients after the failure of assisted insemination with husband sperm (AIH).Methods：The data of 79 IVF-ET cycles of infertile patients after ≥ 3 times of AIH failure in the reproductive medical centre of our hospital from Jan. to Oct. 2014 were analyzed. Thirty cycles had no high-quality embryos transfer or no pregnancy in group A，and 49 cycles had successful pregnancy in group B. The clinical data，number of oocytes retrieved，fertilization rate and number of high-quality embryos were compared between the two groups. The expressions of AsAb and AcAb protein in follicular fluid were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and compared between the two groups.Results：There was no statistically differences in age，duration of infertility，body mass index (BMI) and hormone levels (P>0.05). The fertilization rate and high-quality embryo number in group A were significantly lower than those in group B (P<0.01). The number of oocytes retrieved and cleavage rate were lower in group A than those in group B，but the differences were not significant (P>0.05). The positive rates of AsAb and AcAb in group A were significantly higher than those in group B (P<0.01).Conclusions：The positive expression of AsAb and AcAb in follicular fluid had negative effects on the fertilization，formation of high-quality embryo and embryo implantation in IVF-ET patients after ≥ 3 times of AIH failure.

AIH； IVF-ET； AsAb； AcAb； Pregnancy outcome

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.04.010

2016-09-09；

2016-11-12

珠海市卫生局科研项目(项目编号：2014018)

徐楗荧，女，山东人，博士，副主任医师，生殖医学专业.(*

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