人脐带间充质干细胞移植对大鼠流产模型妊娠结局的影响

2017-04-21 03:58:14陈肖静杨晓清陈薇薇吴荣荣谢绘绘张玉泉
生殖医学杂志 2017年4期
关键词:生理盐水胚胎外周血

陈肖静,杨晓清,陈薇薇,吴荣荣,谢绘绘,张玉泉*

(1.南通大学附属医院,南通 226000;2.南通市肿瘤医院,南通 226361;3.重庆医科大学附属第三医院,重庆 401120)

·实验研究·

人脐带间充质干细胞移植对大鼠流产模型妊娠结局的影响

陈肖静1.2,杨晓清1,陈薇薇3,吴荣荣1,谢绘绘1,张玉泉1*

(1.南通大学附属医院,南通 226000;2.南通市肿瘤医院,南通 226361;3.重庆医科大学附属第三医院,重庆 401120)

目的 探讨人脐带间充质干细胞(WJ-MSCs)移植对大鼠流产模型妊娠结局的影响及机制。 方法 将48只孕鼠随机分为6组,每组8只。生理盐水对照组(a):孕6~8 d皮下注射生理盐水0.4 mg·kg-1·d-1,孕9 d尾静脉注射生理盐水1 ml/kg;乙醇对照组(b):孕6~8 d皮下注射75%乙醇0.4 mg·kg-1·d-1,孕9 d尾静脉注射生理盐水1 ml/kg;流产模型组(c):孕6~8 d皮下注射溴隐亭0.4 mg·kg-1·d-1,孕9 d尾静脉注射生理盐水1 ml/kg;实验组d1、d2、d3分别于孕6~8 d皮下注射溴隐亭0.4 mg·kg-1·d-1,孕9 d尾静脉注射WJ-MSCs 1×105个、1×106个、1×107个(生理盐水使用量为1 ml/kg,将细胞制成混悬液后注射)。各组大鼠均于孕14 d处死并取材,观察各组大鼠胚胎吸收率,RT-PCR检测蜕膜组织白介素-10(IL-10)、干扰素-γ(IFN-γ)和IL-17 mRNA的相对表达量。ELISA检测各组外周血IL-10、IFN-γ和 IL-17的含量。 结果 c组和d1组的平均胚胎吸收数和平均胚胎吸收率均显著高于a、b、d2、d3组(P<0.05)。c组、d1组与a、b、d2、d3组比较,IL-10 mRNA表达显著降低(P<0.05),IFN-γ和IL-17 mRNA表达显著升高(P<0.05)。c组、d1组与a、b、d2、d3组比较外周血IL-10含量显著降低(P<0.05),IFN-γ和IL-17含量显著升高(P<0.05)。c组与d1组间,a、b组与d2、d3组间的观察指标比较均无显著性差异(P>0.05)。 结论 一定浓度的WJ-MSCs移植入大鼠流产模型体内,可以降低胚胎吸收率,改善大鼠流产模型的妊娠结局;其机制可能与WJ-MSCs上调IL-10、下调IFN-γ和 IL-17的含量有关。

流产; 大鼠; Th1/Th2/Th17细胞亚群; 人脐带间充质干细胞

(JReprodMed2017,26(4):366-371)

复发性自然流产(RSA),指同一性伴侣连续或不连续发生两次及以上的自然流产[1-2]。RSA的病因复杂,目前认为与遗传因素、内分泌因素、感染因素、内生殖器解剖异常及免疫因素等有关,其中对免疫因素与RSA关系的研究已成为国内外学者们研究的热点。目前许多对辅助性T细胞(Th)的研究证实,正常妊娠表现为Th2现象,处于Th1抑制状态,Th1型细胞因子过度表达可导致妊娠丢失,Th1/Th2型细胞因子平衡向Th1偏移与原因不明复发性自然流产(URSA)密切相关[3]。近几年有研究发现一类新的CD4+T亚群Th17,其主要分泌白介素-17(IL-17),在胚胎着床及滋养细胞浸润的过程中起着重要作用[4],且作为促炎因子的Th17含量升高可以导致自然流产的发生[5]。间充质干细胞(MSC)是一类多能干细胞,研究表明,它可用于类风湿性关节炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎[6-7]和移植物抗宿主疾病[8]等的治疗。脐带间充质干细胞(WJ-MSCs)是一种新型的种子细胞,其来源广泛、取材容易、易于培养,还具有免疫原性低、能分泌大量细胞因子及无致瘤性[9]、不受伦理限制等优点,因此,WJ-MSCs被认为是成体干细胞的重要来源并且已经成为干细胞研究领域的热点。

本研究将不同浓度WJ-MSCs应用于溴隐亭致大鼠流产模型[10],通过观察不同浓度人WJ-MSCs对妊娠结局的影响,探讨自然流产的发生机制,为其应用于自然流产的临床治疗提供实验依据及新思路。

材料与方法

一、研究对象及主要试剂

1.实验动物:SD雌性大鼠48只(250~300 g)及成熟SD雄性大鼠(均由南通大学动物实验中心提供),用于建立溴隐亭致大鼠流产模型。

2. 主要试剂:溴隐亭(sigma,美国)溶于75%的酒精,浓度为0.4 mg/ml;人WJ-MSCs P1代,由江苏省领航干细胞公司馈赠。Trizol 试剂盒(Taraka,上海),RT-PCR成套试剂盒(Taraka,上海),IL-10、干扰素-γ(IFN-γ)和IL-17引物均由上海生物工程公司合成。IL-10、IFN-γ及IL-17 ELISA试剂盒(eBio-science,美国)。

二、研究方法

1. 动物分组和模型制作[10]:取SD雌性大鼠(250~300 g)和成熟雄性SD大鼠,适应性饲养1 w后,每天于晚18时雌雄1∶1合笼,第2天早晨8点检栓,观察到阴道栓者定为孕第1天。均成功受孕后,将48只孕鼠随机分为6组:生理盐水对照组(a):孕6~8 d皮下注射生理盐水0.4 mg·kg-1·d-1,孕9 d尾静脉注射生理盐水1 ml/kg;乙醇对照组(b):孕6~8 d皮下注射75%乙醇0.4 mg·kg-1·d-1,孕9 d尾静脉注射生理盐水1 ml/kg;流产模型组(c):孕6~8 d皮下注射溴隐亭0.4 mg·kg-1·d-1,孕9 d尾静脉注射生理盐水1 ml/kg。实验组d1、d2、d3分别于孕6~8 d皮下注射溴隐亭0.4 mg·kg-1·d-1,孕9 d尾静脉注射WJ-MSCs 1×105个、1×106个、1×107个(生理盐水使用量为1 ml/kg,将细胞制成混悬液后尾静脉注射移植)。

2. 实验取材及检测方法:各组大鼠于孕14 d,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(剂量为0.8 ml/只),打开胸、腹腔,抽取各组腹主动脉血,置于室温下30 min,待血液凝固后,置离心机1 000 rmp离心10 min,吸取上层血清,置-20℃冰箱备用。然后暴露子宫,观察妊娠结局,计数各组胚胎吸收情况,并进行实验取材。胚胎吸收的判定方法:胚胎完全吸收接近未孕状态或胚胎体积缩小,胚胎-胎盘单位有明显淤血、组织变性或坏死,观察到此现象计为胚胎吸收。胚胎吸收率计算:胚胎吸收率=胚胎吸收数/(胚胎吸收数+未吸收胚胎数)×100%。标本处理方法:将胚胎从子宫剥离,胚胎-胎盘单位连同蜕膜用生理盐水漂洗后,将新鲜组织直接放入冻存管,置于-80℃冰箱备用;RT-PCR检测胎盘蜕膜组织的IL-10、IFN-γ和IL-17 mRNA相对表达量。ELISA方法检测各组大鼠外周血IL-10、IFN-γ和 IL-17的含量变化。检测均按试剂盒说明书进行操作,进行逆转录反应的引物序列见表1。

表1 IL-10、IFN-γ和IL-17 mRNA引物序列

三、统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析,所得结果计数资料组间比较采用χ2检验,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、成功复制溴隐亭致大鼠流产模型

通过实验可以观察到,在皮下注射溴隐亭后,成功导致孕鼠流产,表现为明显的阴道流血,部分胚胎完全吸收接近未孕状态,或胚胎体积缩小,胚胎-胎盘单位有明显淤血、组织变性或坏死。对照组则无阴道流血,胚胎大小均一,呈串珠状,淡粉色。提示溴隐亭致大鼠流产模型的复制是成功的。

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二、大体观察各组妊娠结局

a组和b组胚胎大小均一,呈串珠状,淡粉色;d2、d3组与a、b组大体观察相同;c组部分胚胎完全吸收接近未孕状态或胚胎体积缩小,胚胎-胎盘单位有明显淤血、组织变性或坏死,即为流产胚胎,部分胚胎大体观察同对照组;d1组大体观察与流产模型c组没有区别(图1)。

三、计数各组胚胎吸收情况

c组和d1组的平均胚胎吸收数和平均胚胎吸收率均显著高于a、b、d2、d3组(P<0.05),而c组与d1组间,a、b组与d2、d3组间的平均胚胎吸收数和平均胚胎吸收率均无显著性差异(P>0.05);各组平均胚胎数之间差异不具有统计学意义(P>0.05)(表2)。

四、PCR检测各组IL-10、IFN-γ和IL-17 mRNA表达水平比较

五、ELISA检测各组外周血IL-10、IFN-γ和IL-17的含量

c组和d1组与a、b、d2、d3组比较外周血IL-10含量显著降低(P<0.05),外周血IFN-γ和IL-17含量显著升高(P<0.05)。3种因子在c组与d1组间,a、b组与d2、d3组间含量比较无显著性差异(P均>0.05)(表3)。

a:生理盐水对照组;b:乙醇对照组;c:流产模型组;d1、d2、d3分别为实验1组、2组、3组图1 孕14 d时大体观察各组妊娠结局

组别例数平均胚胎数(个)平均胚胎吸收数(个)平均胚胎吸收率a81188±155075±071∗616∗b81238±141088±064∗731∗c81275±139588±0994623d181175±104513±0084361d281200±120125±089∗1031∗d381150±120138±052∗1221∗

注:与c组、d1组比较,*P<0.05

a:生理盐水对照组;b:乙醇对照组;c:流产模型组;d1、d2、d3分别为实验1组、2组、3组。与c组、d1组比较,*P<0.05图2 各组IL-10、IFN-γ和 IL-17 mRNA相对表达量比较

表3 各组外周血IL-10、IFN-γ和 IL-17的含量(x-±s)

注:与c组、d1组比较,*P<0.05

讨 论

研究认为,在妊娠过程中,母胎界面的子宫蜕膜局部聚集了多种免疫活性细胞,它们分别产生的不同细胞因子发挥着各自不同作用,母体免疫系统对胚胎具有免疫营养和免疫防护作用,其与胚胎源性抗原之间的免疫平衡状态是胚胎正常生存的必要条件,一旦这种平衡遭到破坏,可导致RSA的发生[11]。研究表明溴隐亭致大鼠流产模型的发病过程中,血清催乳素(PRL)和孕激素浓度的降低与临床上黄体功能不足相似,且具有Th1/Th2平衡偏向 Th1型反应等特点,易导致流产的发生[10],为实验研究自然流产提供理论依据。本实验通过观察各组胚胎吸收情况,在皮下注射溴隐亭后,部分胚胎完全吸收接近未孕状态,或胚胎体积缩小,胚胎-胎盘单位有明显淤血、组织变性或坏死;对照组则胚胎大小均一,呈串珠状,淡粉色,表明复制溴隐亭致大鼠流产模型是成功的。

Th1型细胞因子包括IFN-γ、IL-2等,其可以介导细胞免疫,产生细胞毒作用,排斥胚胎组织,引起流产。研究表明,IFN-γ可以减少母胎界面凋亡细胞数量,破坏胎盘结构,使母体蜕膜淋巴细胞易于进入胎儿并发挥其细胞毒作用;IFN-γ还可以下调妊娠过程中转化生长因子-β1(TGF-β1)表达,影响细胞因子的生物学功能,从而影响滋养层对子宫的入侵[12]。有实验研究将Th1型细胞因子IFN-γ和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)注射入孕鼠体内,可导致流产发生[13]。Th2型细胞因子主要包括IL-4、IL-5、IL-10等,有保护胚胎的作用。RSA患者体内循环系统中IL-10的低水平表达及早孕绒毛组织滋养细胞表面IL-10表达下降,可能使得细胞免疫增强,滋养细胞植入异常,胎盘浅着床,影响胚胎发育,导致早期自然流产[14-15]。IL-17是T淋巴细胞诱导的炎症反应的启动因素之一。它是由活化的CD4+CD45RO+记忆T淋巴细胞(即Th17细胞)产生的一种前炎症细胞因子[16]。近几年研究表明Th17细胞作为1种促炎因子,其升高将会导致流产的发生。外周血Th1偏移现象与产生IL-17的T细胞水平是一致的,Th1/Th2向Th1偏移,IL-17数量增加引起免疫炎症反应这些都是RSA发生的促进因素[17]。

本实验检测了IFN-γ、IL-10、IL-17在母胎界面蜕膜组织及外周血的含量。流产模型组(c组)IL-10的含量较生理盐水对照组(a组)及乙醇对照组(b组)显著降低,IFN-γ含量较对照组显著升高(P<0.05)。表明流产模型体内Th1型细胞因子IFN-γ浓度显著增高,而正常妊娠期母体Th2型细胞因子IL-10显著增高,Th1型细胞炎性免疫反应对妊娠不利。另外本实验也检测了母胎界面及外周血IL-17的含量,流产模型组IL-17的含量较两对照组显著升高(P<0.05)。本实验结果与之前文献报道[13-14,17]相似。

WJ-MSCs已经成为MSC的重要来源,其独特的免疫学特性使其在免疫性疾病治疗领域具有广泛的应用前景。Aggarwal等[18]通过MSC与提纯的各种免疫细胞共培养,发现其能减少Th1细胞分泌IFN-γ,促进Th2分泌IL-4。体外研究显示,MSCs可诱导外周淋巴系统Treg细胞分化和增殖,后者可抑制Th17细胞的分化和功能[19]。在体内研究中,MSC可抑制Th17细胞活性,减少IL-17表达和中枢神经系统炎细胞浸润[20]。在有关胶原诱导性关节炎的研究中,MSCs可通过抑制Th17细胞功能减轻关节炎症状[21]。以上研究表明人WJ-MSCs对T细胞具有免疫调节作用。

本实验中,将WJ-MSCs移植入流产大鼠模型体内,通过大体观察,发现WJ-MSCs移植入流产大鼠模型且当移植细胞达到一定浓度时可以减少胚胎丢失率,改善妊娠结局;且IL-10在母胎界面及外周血的含量较流产模型组显著升高,IFN-γ及IL-17含量较流产模型组显著降低(P<0.05)。本实验结果表明WJ-MSCs改善妊娠结局的机制可能与通过改变Th1/Th2因子平衡状态,降低IL-17的含量有关。但其具体是通过自分泌细胞因子还是旁分泌作用以及是否有其他因子参与这一免疫调节过程等尚需进一步研究。本实验将WJ-MSCs应用于自然流产动物模型是一种新的治疗方法,为其应用于临床提供了实验依据和新的思路。

[1] Jurkovic D,Overton C,Bender-Atik R. Diagnosis and management of first trimester miscarriage[J]. BMJ,2013,346: f3676.

[2] 肖世金,赵爱民.复发性流产病因学研究进展[J]. 中国实用妇科与产科杂志,2014,30:41-45.

[3] Jin LP,Fan DX,Zhang T,et al. The costimulatory signal upregulation is associated with Th1 bias at the maternal-fetal interface in human miscarriage[J]. Am J Reprod Immunol,2011,66:270-278.

[4] Muzzio DO,Soldati R,Rolle L,et al. B-1a B cells regulate T cell differentiation associated with pregnancy disturbances[J]. Front Immunol,2014,5:6.

[5] Pongcharoen S,Supalap K. Interleukin-17 increased progesterone secretion by JEG-3 human choriocarcinoma cells[J]. Am J Reprod Immunol,2009,61: 261-264.

[6] Hu J,Li H,Chi G,et al. IL-1RA gene-transfected bone marrow-derived mesenchymal stem cells in APA microcapsules could alleviate rheumatoid arthritis[J]. Int J Clin Exp Med,2015,8: 706-713.

[7] Glenn JD,Smith MD,Calabresi PA,et al. Mesenchymal stem cells differentially modulate effector CD8+T cell subsets and exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Stem Cells,2014,32: 2744-2755.

[8] Amorin B,Alegretti AP,Valim V,et al. Mesenchymal stem cell therapy and acute graft-versus-host disease: a review[J]. Hum Cell,2014,27: 137-150.

[9] Subramanian A,Shu-Uin G,Kae-Siang N,et al. Human umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cells do not transform to tumor-associated fibroblasts in the presence of breast and ovarian cancer cells unlike bone marrow mesenchymal stem cells[J]. J Cell Biochem,2012,113:1886-1895.

[10] Cummings AM,Perreault SD,Harris ST. Use of bromoergocryptine in the validation of protocols for the assessment of mechanisms of early pregnancy loss in the rat[J]. Fundam Appl Toxicol,1991,17: 563-574.

[11] Lima PD,Zhang J,Dunk C,et al. Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy[J]. Cell Mol Immunol,2014,11: 522-537.

[12] Liu Z,Chen Y,Yang Y,et al. The effect on MHC class II expression and apoptosisin placenta by IFNgamma administration[J]. Contraception,2002,65:177-184.

[13] Daher S,de Arruda Geraldes Denardi K,Blotta MH,et al. Cytokines in recurrent pregnancy loss[J]. J Reprod Immunol,2004,62:151-157.

[14] 王振荣,刘娜,杜潘艳,等. 反复自然流产患者外周血白介素水平变化检测的意义[J].中国妇幼保健,2013,28:1932-1933.

[15] 闫华,刘慈,杨素娟,等. 原因不明反复自然流产患者主动免疫治疗前后血清白细胞介素-10、巨噬细胞集落刺激因子白血病抑制因子浓度的变化[J]. 生殖医学杂志,2006,15: 22-25.

[16] Behr L,Hekmati M,Fromont G,et al. Intra renal arterial injection of autologous mesenchymal stem cells in an ovine model in the postisehemic kidney[J]. Nephron Physiol,2007,107:65-76.

[17] Lee SK,Kim JY,Hur SE,et al. An imbalance in interleukin-17-producing T and Foxp3+regulatory T cells in women with idiopathic recurrent pregnancy loss[J]. Hum Reprod,2011,26:2964-2971.

[18] Aggarwal S,Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses[J]. Blood,2005,105:1815-1822.

[19] Obermajer N,Popp FC,Soeder Y,et al. Conversion of Th17 into IL-17A(neg) regulatory T cells: a novel mechanism in prolonged allograft survival promoted by mesenchymal stem cell-supported minimized immunosuppressive therapy[J]. J Immunol,2014,193:4988-4999.

[20] Kurte M,Bravo-Alegría J,Torres A,et al. Intravenous administration of bone marrow-derived mesenchymal stem cells induces a switch from classical to atypical symptoms in experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Stem Cells Int,2015,2015:140170. doi: 10.1155/2015/140170.

[21] Park MJ,Park HS,Cho ML,et al. Transforming growth factor β-transduced mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune arthritis through reciprocal regulation of Treg/Th17 cells and osteoclastogenesis[J]. Arthritis Rheum,2011,63: 1668-1680.

[编辑:郭永]

Effect of transplantation of Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells on pregnancy outcome in rats of abortion model

CHENXiao-jing1,2,YANGXiao-qing1,GHENWei-wei3,WURong-rong1,XIEHui-hui1,ZHANGYu-quan1*

1.TheAffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226000 2.DepartmentofGynecology,TumorHospitalofNantong,Nantong226361 3.DepartmentofSocialSecurity,MedicalUniversityofChongqing,Chongqing401120

Objective:To investigate the effect of transplantation of Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells (WJ-MSCs) on the pregnancy outcome in the rats of abortion model.Methods:Forty eight pregnancy rats were divided into six groups and eight for each group: the rats were given subcutaneous injection of saline (0.4 mg·kg-1·d-1) from the 6thto 8thof pregnancy,and tail intravenous injection of saline (1 ml/kg) on the 9thday of pregnancy in saline control group (group a);the rats were given subcutaneous injection of 75% ethanol (0.4 mg·kg-1·d-1) from the 6thto 8thof pregnancy,and tail intravenous injection of saline (1 ml/kg) on the 9thday in ethanol control group (group b);the rats were given subcutaneous injection of bromocriptine (0.4 mg·kg-1·d-1) from the 6thto 8thof pregnancy,and tail intravenous injection of saline (1 ml/kg) on the 9thday in miscarriage model group (group c);the rats given subcutaneous injection of bromocriptine (0.4 mg·kg-1·d-1) from the 6thto 8thof pregnancy,and tail intravenous injection of 1×105,1×106and 1×107WJ-MSCs respectively in group d1,d2 and d3 respectively. All the rats were killed and collected the tissue materials at the 14thgestation days. The embryo resorption rate was observed in every group. The mRNA expression of interleukin (IL)-10,interferon-γ (IFN-γ) and IL-17 in the decidual tissues were detected by RT-PCR. The levels of IL-10,IFN-γ and IL-17 in peripheral blood were detected by ELISA.Results:Embryos absorption rate in group c and group d1 was significantly higher than that in group a,b,d2 & d3 (P<0.05). The mRNA expression of IL-10 was significantly decreased,but mRNA expressions of IFN-γ和IL-17 were significantly increased in group C & d1 compared with group a,b,d2 & d3 (P<0.05). The IL-10 level was significantly decreased and IFN-γ & IL-17 levels were significantly increased in peripheral blood in group c & d1 compared with group a,b,d2 & d3 (P<0.05). There were no significant differences in the observation index between group c and d1,group a,b and group d2,d3 (P>0.05).Conclusions:Transplanting certain amount of WJ-MSCs into the rats of abortion model may reduce the embryo absorptivity,and improve the outcome of pregnancy. The mechanism maybe related with WJ-MSCs up-regulating the expression of IL-10 and down-regulating the expression of IFN-γ and IL-17.

Abortion; Rat; Th1/Th2/Th17 cell subsets; Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.04.015

2016-08-03;

2016-11-12

国家青年自然科学基金资助项目(81401272);江苏省妇幼保健重点资助项目(F201312)

陈肖静,女,江苏南通人,硕士,住院医师,妇科肿瘤及生殖医学方向.(*

,Email:470278241@qq.com)

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