HPLC-PDA法测定食品中微量苏丹红Ⅲ

高瑞苑，武乐晨，张海容

（忻州师范学院生化分析技术研究所，山西忻州034000）

HPLC-PDA法测定食品中微量苏丹红Ⅲ

高瑞苑，武乐晨，张海容

（忻州师范学院生化分析技术研究所，山西忻州034000）

建立了利用高效液相色谱（HPLC）-二极管阵列检测器（PDA）法测定食品中苏丹红Ⅲ的方法。采用的色谱条件为：Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），用乙腈-丙酮（80-20）：水=95∶5作为流动相，检测波长为504 nm，流动相流速为1.0mL/min，柱温为15℃。利用色谱检测苏丹红Ⅲ的浓度在0.03μg/mL～101.86μg/mL时，组分的峰面积与浓度之间线性关系良好，苏丹红Ⅲ的线性方程为A=26 310ρ-911.78（ρ：μg/mL），R2=0.999 2。该方法精密度良好，稳定性较强。检测的4种样品的加标回收率在97.33%～100.00%之间，符合测定要求。高效液相色谱法，方法准确，快速，适用于苏丹红Ⅲ的测定。通过质谱，进一步验证了食品中苏丹红Ⅲ的存在。利用质谱检测到，苏丹红Ⅲ的分子离子峰为m/z 353，主要碎裂成m/z156和m/z197。

高效液相色谱；质谱；苏丹红Ⅲ；食品

苏丹红Ⅲ是一种亲脂性含萘偶氮化工合成染色剂，有染红功能，国际癌症研究机构将其列为三类致癌物，即动物致癌物，将其初级代谢产物4-氨基偶氮苯列为二类致癌，即人类致癌物[1]。但因其价格低廉，被不法商家利用，添加到食品中，比如在辣椒制品添加苏丹红Ⅲ，以增添红色色泽，在蛋禽类饲料中添加苏丹红Ⅲ，以增添蛋黄的色泽。实际上，早在1996年，我国食品添加剂卫生标准中就明令禁止使用苏丹红类染色剂（主要包括苏丹红I～IV），但由于当时缺少检测技术和统一安全标准，无法解决宏观的评估问题[2-3]。目前，世界各国在使用色素作为添加剂时，都明确规定了限量，其安全问题不容忽视。

二十一世纪以来，国内外关于苏丹红I～IV的检测方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱-质谱联用法、分子印迹固相萃取法、毛细管液相色谱-质谱法、电离质谱同位素稀释法等。这些方法已应用于辣椒制品、调味品、熟食、蛋禽类制品等食品中苏丹红I～IV的残留检测工作[4-10]，大多都是同时测定苏丹红I～IV 4种物质，4种物质之间是否存在测定干扰，就不得而知了。二极管阵列检测器可以快速扫描被测组分的光谱图和色谱图，根据食品中苏丹红III组分的保留时间和吸收光谱与标准品的保留时间和吸收光谱比较，可以对苏丹红III进行精确的定性、定量分析[11]。因此，本文选择运用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-PDA）法对食品中苏丹红III进行测定，最后利用质谱进一步定性验证苏丹红III的存在。

1 仪器与试剂

1.1 材料与试剂

乙腈、甲醇（色谱纯）、正己烷、石油醚、乙醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；色谱所用水为超纯水，其他均为二次蒸馏水；丙酮（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；苏丹红III（生物染色剂）、中性氧化铝（100目～300目75%层析）：天津光复精细化工研究所。

样品：干辣椒、辣椒面、家鸡蛋、普通鸡蛋均购至忻州市团结市场；腐乳、辣椒酱、香辣酱：忻州市华美超级商场。

1.2 仪器与设备

Waters 600E高效液相色谱仪、Waters 2998二极管阵列检测器：美国Waters公司；LC-MS 8030液质联用仪、UV-1800型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；KQ-400K型高功率超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；RE-2000旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（III）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；TDL-40B离心机：金坛市友联仪器研究所；SPX-150-Z振荡培养箱：上海跃进医疗器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长：504 nm；柱温：15℃；流动相：乙腈-丙酮（80-20）：水=（95∶5），过0.45 μm滤膜后使用。

1.3.2 质谱条件

色谱柱：Inert Sustain C色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相0.1%甲酸水溶液∶乙腈=15∶85；流速0.4 mL/min；进样量20 μL；柱温40℃；毛细管电压4.5 kV（ESI+）；DL温度250℃；Heat Block温度200℃；雾化气流速1.5 L/min；干燥气流速6 L/min；扫描范围：一级质谱340 m/z～360 m/z，二级质谱100 m/z～400 m/z。

1.3.3 对照品溶液的配制

精密称取苏丹红Ⅲ0.050 9 g，用乙腈溶解并定容到500 mL的容量瓶，得到101.80 μg/mL的混合溶液，避光，4℃下保存。

1.3.4 供试品溶液的制备[12]

干辣椒提取液：将干辣椒磨碎，过60目筛后，称取9.980 0g于100 mL锥形瓶中，加入50 mL正己烷，振荡10 min，超声15 min，静置，过滤。取15 mL滤液注入氧化铝柱中，待溶液全部流出后，泵入10 mL丙酮，洗脱，再用15 mL 98%甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发，乙腈溶解至25 mL，过0.45 μm滤膜后，储存备用。

辣椒面提取液：称取10.010 0 g于100 mL锥形瓶中，加入50 mL正己烷，振荡10 min，超声15 min，静置，过滤。取15 mL滤液注入氧化铝柱中，待溶液全部流出后，泵入10 mL丙酮，洗脱，再用15 mL 98%甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发，乙腈溶解至10 mL，过0.45 μm滤膜后，储存备用。

辣椒酱提取液：称取20.180 0 g于100 mL锥形瓶中，其余步骤同辣椒面提取液制备。

香辣酱提取液：称取20.200 0 g于100 mL锥形瓶中，其余步骤同辣椒面提取液制备。

腐乳提取液：称取20.000 0 g于100 mL锥形瓶中，其余步骤同辣椒面提取液制备。

鸡蛋提取液：分别称取家鸡蛋、普通鸡蛋19.9700g、20.000 g，各置于50 mL离心管中，均加入30 mL乙腈，高速匀浆1 min，超声提取10 min，中速振荡5 min，离心5 min，将上层乙腈层转入100 mL锥形瓶中，用乙腈重复提取3次，每次20 mL，合并乙腈层，45℃减压浓缩，用丙酮少量多次转移残留物并定容至10 mL，混匀，过0.45 μm滤膜，储存备用[1]。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

分别吸取对照品溶液0.015、0.15、1.5、5、7、10、15、50 mL用乙腈定容到 50 mL得到 0.03、0.31、3.05、10.18、14.25、20.36、30.54、101.80 μg/mL的溶液。在“1.3.1”色谱条件分别进样10 μL，测定峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线，A=26 310ρ-911.78（ρ：μg/mL），R2=0.999 2。因此，在0.03 μg/mL～ 101.86 μg/mL范围内，苏丹红Ⅲ的浓度和峰面积呈良好的线性关系（见图1），保留时间在12.8 min（见图2）。

图1 苏丹红Ⅲ标准曲线Fig.1 The standard curve of SudanⅢ

图2 苏丹红Ⅲ对照品的色谱图Fig.2 Chromatogram of reference substance SudanⅢ

2.2 精密度试验

取对照品溶液6 mL稀释到50 mL，过膜后转入样品瓶，在“1.3.1”色谱条件下，重复进样5次，记录峰面积。计算相对标准偏差（RSD）为0.357%，表明此方法精密度良好。

2.3 稳定性试验

取对照品溶液8.3 mL稀释到50 mL，过膜后转入样品瓶，在“1.3.1”色谱条件下，室温放置0、2、4、6、8、16、24 h进样，记录峰面积。结果24 h内峰面积基本不变，计算RSD为0.98%，表明苏丹红Ⅲ稳定性良好。

2.4 样品含量测定

取干辣椒、辣椒面、辣椒酱、香辣酱、腐乳、家鸡蛋、普通鸡蛋的供试品溶液依次进样，在“1.3.1”色谱条件下测定苏丹红Ⅲ的含量，测定结果见表1，其中辣椒酱、香辣酱、腐乳3种样品中没有检测到苏丹红Ⅲ，干辣椒中苏丹红Ⅲ含量较高，辣椒面、家鸡蛋和普通鸡蛋中苏丹红Ⅲ含量较低。

表1 7种样品中苏丹红Ⅲ含量测定结果Table 1 Determination results of SudanⅢcontent in seven kinds of samples

2.5 加标回收率试验

取一定量4种含有苏丹红Ⅲ的样品，加入适量苏丹红Ⅲ对照品溶液，按“1.3.4供试品溶液的制备”方法处理，在“1.3.1”色谱条件下测定，并计算回收率和RSD，结果见表2。

表2 4种样品的加样回收率和相对标准偏差Table 2 Recoveries and RSDs of four kinds of samples

2.6 质谱检测样品中苏丹红Ⅲ

通过一级质谱和二级质谱扫描，得到苏丹红Ⅲ标准品和测定样品中苏丹红Ⅲ的分子离子峰为m/z 353，主要碎裂成m/z156和m/z197（见表3）。由此分析，苏丹红Ⅲ的质谱碎裂方式如图3。

表3 苏丹红Ⅲ的质谱检测结果Table 3 The results of SudanⅢmass spectrometry detection

图3 苏丹红Ⅲ的质谱碎裂示意图Fig.3 The fragmentation pattern of[M+H]+ions of SudanⅢ

3 讨论与结论

3.1 检测波长的确定

利用紫外可见分光光度计测定苏丹红Ⅲ的紫外吸收光谱，见图4。

图4 苏丹红Ⅲ的紫外吸收光谱Fig.4 UV-absorption spectra of SudanⅢ

苏丹红Ⅲ在348 nm和504 nm处有最大吸收，由于504 nm处的吸收强于348 nm处，因此选择504 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择

尝试乙酸水-乙腈体系，保留时间在20 min～40 min左右，时间较长，且峰宽较宽、有拖尾。乙酸水-甲醇体系保留时间依然较长，较乙酸水-乙腈体系，峰宽变宽，拖尾前移。两种体系比较，乙酸水-乙腈体系更有优势，但保留时间均较长，而且乙酸的加入并不能消除拖尾，因此考虑有机相中加入丙酮，乙酸水换成水。乙腈-丙酮-水体系保留时间大大缩短，且峰形较好。随着乙腈比例的增加，保留时间推后，但乙腈-丙酮（75-25）∶水=95∶5时有拖尾，而以乙腈-丙酮（80-20）∶水=95∶5时，保留时间适中，峰形对称。

乙腈-丙酮（80-20）∶水不同比例时，随着有机项比例的增加，保留时间缩短，峰宽缩小，但流动相为乙腈-丙酮（80-20）∶水=97.5∶2.5时，峰的对称性较差，拖尾较明显，因此流动相的比例选用乙腈-丙酮（80-20）∶水=95∶5。

3.3 流速的选择

以乙腈-丙酮（80-20）∶水=95∶5为流动相，柱温25℃，检测波长504 nm，分别设置流速0.5、0.75、1.0、1.25 mL/min进行色谱测定。结果表明，随着流速增大，保留时间减小，而且减少的幅度越来越小，在试验过程中，结合对色谱柱的考虑，选择了适中流速1.0 mL/min。

3.4 柱温的选择

以乙腈-丙酮（80-20）∶水=95∶5为流动相，检测波长504 nm，流速1.0 mL/min，分别设置柱温为15、20、25、30、35℃，进行色谱测定。结果表明，柱温每升高5℃，保留时间减小约1 min左右，且有拖尾出现，对称性较差，而柱温15℃时，无拖尾，且峰型较好，对称性高，因此选择柱温为15℃。

因此，选择色谱条件：流动相为乙腈-丙酮（80-20）∶水=95∶5，流速1.0 mL/min，柱温15℃，检测波长504 nm下测定苏丹红Ⅲ，保留时间在12.8 min，峰宽50.000，峰形对称，无拖尾。

3.5 结论

本文利用HPLC-PDA法测定了辣椒制品和鸡蛋七种食品中苏丹红Ⅲ的微量含量。该方法操作简便、快速，精密度、稳定性良好。在检测过程中，线性范围较宽，回收率较好，完全能够满足测定要求。通过质谱，进一步验证了检测到的4种食品中苏丹红Ⅲ的存在，利用质谱检测到苏丹红Ⅲ的分子离子峰为m/z 353，主要碎裂成m/z 156和m/z 197。

[1] 陈蔷,班付国,贾振民,等.超高效液相色谱法测定鸡蛋中苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的残留[J].中国兽药杂志,2009,43(2):24-27

[2] 庞艳玲,王怀友.薄层色谱-紫外可见分光光度法测定食品中的苏丹红Ⅲ[J].化学分析计量,2006,15(6):69-70,108

[3]李吉平,刘文森,高宏伟,等.HPLC紫外检测法测定辣椒制品中苏丹红I～IV号含量的研究[J].食品科学,2007,28(8):332-336

[4] 王坤,赵浩军,张燕.高效液相色谱法测定辣椒油中的苏丹红染料[J].云南化工,2015,42(1):38-41

[5] 李勇竞.高效液相色谱法快速测定辣椒酱中的苏丹红[J].安徽预防医学杂志,2010,16(5):354-356

[6]李军,雍炜,李刚,等.HPLC法测定辣椒及其制品中苏丹红色素含量[J].检验检疫科学,2005,15(2):43-45

[7] 刘家阳,李敏,贾宏欣,等.超高效液相色谱快速检测禽蛋类食品中苏丹红(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)[J].中国卫生检验杂志,2013,23(3): 599-600

[8] 宋伟华,韩子婵,马喜花,等.红腐乳及含油着色食品中苏丹红Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的高效液相色谱法测定[J].分析试验室,2007,26 (12):208-211

[9] 于林,孟冰冰,杨桂玲.辣椒制品中的苏丹红检测方法的优化[J].中国调味品,2014,39(7):123-125

[10]陈俊波.高效液相色谱法检测食品中苏丹红Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ的研究与应用[J].安徽化工,2007,33(1):60-61

[11]喻凌寒,牟德海,李光宪.HPLC-DAD法测定辣椒及其制品中苏丹红的含量[J].光谱实验室,2004,21(6):1131-1133

[12]全国分析检测人员能力培训委员会.液相色谱分析技术标准汇编[M].北京:中国标准出版社,2013:206-214

Determination of Trace SudanⅢin Foodstuffs by HPLC-PDA

GAO Rui-yuan，WU Le-chen，ZHANG Hai-rong
（Laboratory of Biochemical Analysis，Xinzhou Teachers'College，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

A HPLC-PDA method was established for determination of trace SudanⅢin foodstuffs.The chromatographic conditions were：Symmetry C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm）was used with mobile phases composedofacetonitrile-acetone（80-20）：water=95∶5，under the detection wavelength for 504 nm，1.0 mL/min as the flow rate，column temperature 15℃.The peak area and the concentration of SudanⅢshowed a good linear relationship：A=26 310ρ-911.78（ρ：μg/mL），R2=0.999 2，in the range of 0.03 μg/mL-101.86 μg/mL.The above method precision was good and stability was strong.The adding standard recoveries of four kinds of samples were between 97.33%-100.00%，according with the requirement of the determination.HPLC-PDA method was accurate and fast and it could be used for the determination of SudanⅢ.To further validate the existence of SudanⅢin these samples by mass spectrometry.Mass spectrometry showed that SudanⅢmolecular ion peak was m/z 353，main cracked into m/z 156 and m/z 197.

high performance liquid chromatograph；mass spectrometry；SudanⅢ；foodstuffs

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.031

2016-07-26

忻州师范学院青年基金项目（QN201519）；忻州师范学院应用化学创新实践基地（2013-31）

高瑞苑（1988—），女（汉），助教，硕士研究生，从事物质分离、提取工作。