干旱胁迫下喷施甲基环丙烯对苗期甘蔗SoMAPK4基因表达的影响

［KH－*3D］方位宽，何姗珊，王冠玉，经艳，谭芳，梁朝旭*，李鸣*

(1．广西农业科学院甘蔗研究所，广西南宁530007;2．广西农业科学院，广西南宁530007)

干旱胁迫下喷施甲基环丙烯对苗期甘蔗SoMAPK4基因表达的影响

［KH－*3D］方位宽1，2，何姗珊1，王冠玉2，经艳1，谭芳1，梁朝旭1*，李鸣1*

(1．广西农业科学院甘蔗研究所，广西南宁530007;2．广西农业科学院，广西南宁530007)

研究甲基环丙烯(1-MCP)对甘蔗苗期叶片促分裂原活化蛋白激酶基因表达的影响，为研究1-MCP对甘蔗苗期抗旱影响提供参考。结果表明，在正常供水情况下，甘蔗SoMAPK4基因在转录水平上的表达量不受1-MCP一次处理影响，而二次处理后So-MAPK4表达量呈下调趋势。干旱胁迫时，1-MCP对甘蔗SoMAPK4基因在转录水平上的表达量呈先增后减、协同增减的动态变化趋势，且SoMAPK4基因表达量上升比较明显，第5天达到最大值。二次处理后SoMAPK4表达量出现明显增加，随干旱胁迫时间增加而逐渐减弱。由此说明，在干旱胁迫下1-MCP二次处理，能够增加甘蔗SoMAPK4基因在转录水平上的表达量，且随干旱胁迫时间增加，SoMAPK4基因表达量在转录水平上增加。

1-MCP;甘蔗;SoMAPK4;基因表达

甘蔗(Saccharum officinarum L．)广泛生长于热带和亚热带地区，是我国最主要的糖料经济作物，也是广西最重要的经济作物之一。随着全球气候变暖，广西频繁遭受旱灾袭击，已成为制约其蔗糖生产的重要因素之一，也是广西农业生产所面临的最突出的问题之一［1－2］。

近年来，甲基环丙稀(1-methylpropylene，1-MCP)在国内外被大量应用于农产品冷藏保鲜、改善蔬果品质等方面;随着分子生物学研究的不断发展，利用1-MCP提高作物抗病抗寒、抗旱性和减轻逆境胁迫对作物造成的不利影响已成为一个新的研究热点。关于甘蔗抵抗逆境胁迫生理生化机制的研究，主要表现在其抗氧化防御方面。促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)是一类存在于各种真核生物体中的丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶，参与多种信号传递过程，通过对转录因子的磷酸化，调控多种基因的表达。有研究表明，MAPK级联信号传递途径在渗透调节、激素反应、细胞增殖和分化以及外界逆境胁迫等反应中起着非常重要的作用［3］。张孝华等［4］研究在水分胁迫下玉米促分裂活化蛋白激酶在玉米叶片细胞抗氧化损伤中的作用结果表明，MAPK级联途径参与了水分胁迫下细胞氧化损伤的信号转导途径，缓解了水分胁迫对细胞的氧化损伤，对其抗氧化损伤起一定的正调控作用。半定量反转录—聚合酶链反应(semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction，SqRT-PCR)是近年来发展起来的一种简捷、应用广泛、特异的定量RNA测定方法和探讨基因转录水平的有效手段［5］。张晓娟等［6］和汪月霞等［7］分别以小麦为材料，采用半定量(RT-PCR)分析技术，研究小麦幼苗在水分胁迫和复水条件下类脱水素基因与psbA基因的表达情况。本文探讨干旱胁迫下1-MCP对甘蔗SoMAPK4基因表达量的影响，利用半定量PCR方法，研究甘蔗SoMAPK4基因在甘蔗苗期干旱胁迫下，利用1-MCP处理后甘蔗叶片中So-MAPK4基因表达量的动态变化，初步探讨1-MCP对甘蔗苗期抗旱性作用机理，为今后利用甲基环丙烯改善和提高甘蔗苗期抗旱性提供一定参考。

1 材料与方法

1．1 试验材料

供试甘蔗品种为新台糖22号(ROC22)。试剂甲基环丙烯(1-MCP)由甘肃奥扬高科纳米技术有限公司提供。

1．2 试验方法

本研究室内试验在广西农业科学院甘蔗研究所重点实验室完成，桶栽试验在人工气候室开展，参考王小乐等［8］方法略加改进。试验用塑料桶直径35 cm，高32 cm。试验用土采自甘蔗田耕作层土壤，为南方红壤土，甘蔗种植时塑料桶中土壤层厚28 cm。每桶种6个芽，呈梅花形摆放，下种前分别用甲基托布津和石灰水浸种。出苗后选取苗数、大小和生长一致的桶栽苗，待甘蔗苗生长至5～7片完全叶时，用1-MCP处理，本试验共4个处理，即A:正常供水(CK1)、B:正常供水+1-MCP(1 mg/L)、C:干旱胁迫(CK2)和D:干旱胁迫+1-MCP(1 mg/L)。每个处理10桶，3次重复。试验分为一次处理和二次处理，每次处理16 h，二次处理是在一次处理结束后复水至土壤正常供水7 d后再次熏蒸处理。

实验采用随机区组设计，在封闭的人工气候室，用1 mg/L的1-MCP气体连续密闭熏蒸16 h。通过测定土壤相对含水量等指标，控制土壤水分胁迫程度。甘蔗叶片自1-MCP处理结束起连续采样7 d，至水分胁迫使甘蔗苗枯萎为止。

1．3 取样与测定

田间最大持水量采用环刀法测定，土壤相对含水量测定(Relative water content，Rwc)参照林大仪［9］的方法并略作改动。参照国家标准GB/T 20481-2006，将土壤分为无旱(Rwc＞60%)、轻旱(50%≤Rwc＜60%)、中旱(40%≤Rwc＜50%)和重旱(30%≤Rwc＜40%)4种干旱程度。

随机分别采集各处理4株甘蔗苗+1叶等量混合，置于液氮速冻后带回实验室。利用TIANGEN公司植物总RNA提取试剂盒和cDNA第一链合成试剂盒，分别提取甘蔗总RNA并将RNA合成cDNA。以甘蔗Actin基因(GenBank Accession No．AY742219)作为内参基因，参照Actin基因相关序列设计引物primer 1和primer 2(表1)。以李粲［10］等发表的甘蔗SoMAPK4(GenBank Accession No．JQ062930)基因序列为依据，利用Premier5．0和DNAman软件设计半定量PCR引物primer 3和primer 4。以各处理样品的cDNA为模板，用引物primer 1/primer 2和primer 3/primer 4分别扩增Actin基因和SoMAPK4基因，PCP反应体系为:10× PCR Buffer 2．5 μl，10 mmol/L dNTPs Mixture 0．5 μl，primer 1/primer 2(10 μmol/L)(或者primer 3/ primer 4)各1．0 μl，ddH2O 19．3 μl，cDNA模板0．5 μl，总体积25．0 μl。反应程序为:94℃预变性3 min;94℃30 s，65℃30 s，72℃1 min，进行25个循环，4℃保存。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳仪恒压120 V，电泳30 min。

1．4 数据处理

试验所得数据采用SPSS 20．0软件进行统计分析。SoMAPK4基因半定量电泳检测后使用凝胶影像分析软件(Image J)测定每个条带的灰度值，后计算SoMAPK4基因条带与内参基因(Actin)条带的灰度值比值，该值即为SoMAPK4基因的相对表达量，并进行数据统计分析。

2 结果与分析

2．1 不同处理时期土壤相对含水量动态变化

由图1和图2可知，正常供水A和B处理，在两次处理的测定中均未受到水分胁迫，土壤相对含水量维持在70%～80%;而水分胁迫处理C和D随时间增加土壤相对含水量呈下降趋势，自第3天起各处理均处于轻度水分胁迫状态，第4～5天为中度水分胁迫，第6～7天为重度水分胁迫，此时土壤含水量为30%～40%，桶栽甘蔗苗呈重度干旱状态。

图1 一次处理土壤相对含水量Fig．1The soil relative water content condition in the 1sttreatment

2．2 RNA提取及质量检测

取甘蔗总RNA 1 μl，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明甘蔗总RNA具有完整的28 S、18 S和5 S，且条带清晰明亮，无降解，无DNA和蛋白质等污染(图3)。利用紫外分光光度计分别在波长260和280 nm下，测量RNA的OD值，并计算出OD260/ OD280比值约为2．0，表明甘蔗叶片的总RNA提取的质量较高，完全满足反转录合成cDNA的要求(图3～4)。

图3 1-MCP一次处理甘蔗叶片总RNA电泳图Fig．3The sugarcane leaf total RNA electrophoresis figure of 1-MCP 1st treatment

图4 1-MCP二次处理甘蔗叶片总RNA电泳图Fig．4The sugarcane leaf total RNA electrophoresis figure of 1-MCP 2ndtreatment

2．31 -MCP一次处理对甘蔗SoMAPK4基因表达量的影响

如图5～6所示，在正常供水条件下，处理A和B之间的基因表达量之间并没有特别显著的差异。说明在没有干旱胁迫的情况下，使用1-MCP处理后甘蔗SoMAPK4基因表达量不会有太大的变化和差异。在水分亏缺的条件下，处理C和D之间SoMAPK4基因表达量呈现出先增后减、协同增减的规律，而且在中度干旱胁迫时表达量上升比较明显，且在第5天达到了最大值。其中，使用1-MCP处理后的处理D在中度胁迫过程中SoMAPK4激酶基因表达量略高于处理C，而在重度干旱胁迫条件下表达量又开始减少，且低于处理C。说明随着干旱时间的延长，甘蔗SoMAPK4基因表达量会有所增加，但是在重度干旱胁迫时由于甘蔗细胞膜受损害程度太大，细胞内信号传导能力严重下降，SoMAPK4基因表达活化能力会有所下降，MAPK信号途径受阻，从而导致植物抵抗逆境胁迫的能力也随之降低。

图5 1-MCP一次处理后甘蔗叶片SoMAPK4基因Semi-PCR结果Fig．5The results of semi-PCR amplifying SoMAPK4 gene in sugarcane leaves 1sttreated by 1-MCP

2．41 -MCP二次处理对甘蔗MAPK激酶基因半定量表达的影响

如图7～8所示，在正常供水条件下，处理B的SoMAPK4基因表达量呈现出下调的趋势，自第2天起SoMAPK4基因在转录水平的表达量一直低于A处理束。说明在正常供水下，甘蔗在使用1-MCP二次处理后在转录水平的表达量一直降低。而在干旱胁迫下，1-MCP二次处理后基因在转录水平的表达量与一次处理变化趋势一致，都呈现出先增后减、协同增减的规律。处理C和D在中度干旱胁迫下使用第二次1-MCP处理后SoMAPK4表达量出现明显增加，并持续到重度干旱胁迫才逐渐减弱。说明在中度干旱胁迫下使用1-MCP第二次处理，能够增加甘蔗SoMAPK4基因在转录水平上的表达量，且在重度干旱胁迫条件下持续MAPK4基因在转录水平上表达量的增加。

图6 1-MCP一次处理后甘蔗叶片SoMAPK4基因表达量Fig．6The gene expressing content of SoMAPK4 in sugarcane leaves 1st treated by 1-MCP

图7 1-MCP二次处理后甘蔗叶片SoMAPK4基因Semi-PCR结果Fig．7The results of semi-PCR amplifying SoMAPK4 gene in sugarcane leaves 2ndtreated by 1-MCP

图8 1-MCP二次处理后甘蔗叶片SoMAPK4基因表达量Fig．8The gene expressing content of SoMAPK4 in sugarcane leaves 2ndtreated by 1-MCP

3 讨论

促分裂原活化蛋白激酶MAPK是细胞信号转导中极为重要的一类蛋白激酶，各种环境胁迫，如极端温度、渗透胁迫及紫外辖射等都能通过MAPK信号途径在生物体内引发相应的反应，进而调控特定基因的表达，最终引起植物产生抵抗胁迫的生理生化反应［8］。有研究表明，ROS的信号传导与促分裂原活化蛋白激酶有关，植物在受到逆境胁迫时会产生大量的ROS和H2O［9－10］2。Guan等［11］研究发现，H2O2是生物防御反应中一个重要的信号物质，也是MAPK的强激活剂。大量的ROS和H2O2累积会引起细胞内MAPK激酶活性的变化，从而激发一系列磷酸化、去磷酸化反应的信号传递过程［12－13］。本研究结果表明，在正常供水情况下，使用1-MCP一次处理和二次处理后，对甘蔗SoMAPK4基因在转录水平上的表达具有不同程度的影响。用1-MCP一次处理后处理A和处理B之间SoMAPK4基因的表达量维持在一个较为恒定的水平，而用1-MCP二次处理后，处理B的SoMAPK4基因在转录水平上的表达量呈下调趋势。二次处理后自第2天起，SoMAPK4基因的表达量一直低于处理A。说明，在没有受到干旱胁迫时，1-MCP二次处理会产生抑制SoMAPK4基因表达的作用，这可能是由于反复使用1-MCP会过多的抢占甘蔗叶片表面的乙烯受体，致使乙烯信号传导过程受阻，某些正常的生物信号无法及时激活位于信号传导途径下游的MAPK级联途径，因此造成SoMAPK4基因在转录水平的表达量低于正常供水对照处理。相反，在干旱胁迫过程中，使用1-MCP一次处理和二次处理后，甘蔗叶片SoMAPK4基因表达量呈先增后减、协同增减的变化规律，且都在中度干旱胁迫时表达量增幅最为明显，重度干旱胁迫时下降。其中，使用1-MCP二次处理后较一次处理在重度干旱胁迫下，能够长时间维持基因在转录水平上的表达量。由此说明，受到干旱胁迫初期，甘蔗叶片细胞内会产生ROS和H2O2激活激酶活性，促进基因的上调表达，但是随着干旱程度的不断增加，SoMAPK4基因的表达量也随之增加，从而协助调控细胞内外激素以及渗透调节物质，维持细胞内适宜的生理生化反应来抵御干旱胁迫的危害。但在重度干旱胁迫时，由于细胞内ROS和H2O2过量积累，位于信号传导下游的MAPK级联途径会向上游的ABA产生反馈调节的作用，促使ABA积累，从而诱导气孔关闭，减少叶片内外水分蒸发和散失来延缓干旱胁迫对甘蔗叶片的伤害。

4 结论

在正常供水情况下，用1-MCP一次处理后对甘蔗叶SoMAPK4基因在转录水平上的表达量影响不大;1-MCP二次处理后使SoMAPK4基因在转录水平的表达量呈现下降趋势。此外，在干旱胁迫过程时，使用1-MCP处理后甘蔗叶片SoMAPK4基因在转录水平上的表达量产生先增后减、协同增减的变化规律，促使甘蔗在受到干旱胁迫时可以通过调控So-MAPK4基因的表达量来维持细胞内适宜的生理生化反应以抵御干旱胁迫的危害。

［1］滕峥，韦继敏，梁林顺，等．几个甘庶品种(系)农艺性状及抗旱生理生化性状比较［J］．南方农业学报．2011，42(7):728－731．

［2］杨建波，诸葛少军，黎海涛，等．干旱胁迫对甘蔗生长生理的影响及品种抗旱性评价［J］．南方农业学报，2012，43(8):1114－1120．

［3］YANG S H，SHRROCKS A D，WHITMASH A J．Transcriptional regulation by the MAP kinase signaling cascades［J］．Gene，2003 (320):3－21．

［4］张孝华，丁海东，张阿英，等．MAPK在水分胁迫下玉米叶片细胞抗氧化损伤中的作用［J］．南京农业大学学报，2009，32(2):156－160．

［5］丁国华，许春梅，于虹，等．黄瓜RGA基因的半定量RT2PCR表达分析［J］．西北植物学报，2010，30(4):645－651．

［6］张晓娟，张林生，杨颖．水分胁迫下小麦类脱水素基因表达的半定量RT2PCR分析［J］．西北植物学报，2007，27(11):2158－2162．

［7］汪月霞，索标，赵鹏飞，等．外源ABA对干旱胁迫下不同品种灌浆期小麦psbA基因表达的影响［J］．作物学报，2011，37(8): 1372－1377．

［8］王小乐，李鸣，蔡立群，等．水分胁迫下喷施乙烯利和甲基环丙烯对甘蔗苗期叶片抗氧化酶活性的影响［J］．南方农业学报，2014，45(9):1558－1565．

［9］林大仪．土壤学实验指导［M］．北京:中国林业出版社，2004:89－90，98－99．

［10］李粲，滕峥，刘开雨，等．甘蔗MAP激酶基因SoMAPK4克隆与生物信息学分析［J］．南方农业学报，2012，43(6):727－732．

［11］Guan L M，Zhao J，Scandalios J G．Cis-elements and trans-factors that regulate expression of the maize Cat1 antioxidant gene in response to ABA and osmotic stress:H2O2is the likely intermediary signaling molecule for the response［J］．Plant Journal，2000，22 (2):87－95．

［12］Kong X P，Sun L P，Zhou Y，et al．ZmMK4 regulates osmotic stress through reactive oxygen species scavenging in transgenic tobacco［J］．Plant Cell Reports，2011，30(11):2097－2104．

［13］王丽，刘洋，李德全．植物干旱胁迫信号转导及其调控机制研究进展［J］．生物技术通报，2012，10:1－7．

(责任编辑 陈格)

Effect of 1-MCP on SoMAPK4 Gene Expression under Drought Stress in Sugarcane Seedling Stage

FANG Wei-kuan1，2，HE Shan-shan1，WANG Guan-yu2，JING Yan1，TAN Fang1，LIANG Zhao-xu1*，LI Ming1*
(1．Sugarcane Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Guangxi Nanning 530007，China;2．Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Guangxi Nanning 530007，China)

Study on 1-methylpropylene(1-MCP)which affected the gene expression of mitogen-activated protein kinases(SoMAPK)in seedling stage of sugarcane was provided the theory basis about 1-MCP influence on sugarcane seedling drought resistance．Results showed that: under the condition of normal water supply，the expression of transcriptional level about SoMAPK4 genes in sugarcane leaves was influenced little by 1-MCP treatment once，and after secondary treatment，a lower trend of the gene expression was showed．In drought stress，the expression of transcription level which 1-MCP influenced on SoMAPK4 gene in sugarcane leaves was presented rising and then declining，a trend of increase or decrease together，the expression of SoMAPK4 rised significantly and reached at maxmum after 5 days．The expression of SoMAPK4 was increased obviously，but became feeble with extending of drought time．Therefore，the expression of SoMAPK4 was increased at transcription level and became more apparent with drought time delaying．

1-MCP;Sugarcane;SoMAPK4;Gene expression

S566

A

1001－4829(2017)1－0040－05

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．008

2016－09－07

国家自然基金项目(31460093);广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻1598006-1-1D，桂科AB16380258);广西农科院科技发展基金项目(桂农科2015JM05)

方位宽(1976－)，男，广西百色人，硕士，助理研究员，主要从事甘蔗育种研究，E-mail:gxnnxf@163．com，*为通讯作者，E-mail:gxua9606@163．com，nnlzx@126．com。