619例胎儿脐血产前诊断结果分析

方美仙　王　燕　黄海龙　何德钦　林　娜　林　元*

1.福建医科大学附属南平市第一医院(353000);2.福建医科大学附属福建省妇幼保健院

胎儿染色体异常是常见出生缺陷的原因之一，约占全部活产胎儿的1/500[1]，常伴有智力低下、发育迟缓、多器官畸形，目前尚无有效的治疗方法，介入性产前诊断是主要的干预措施。而对于较大孕周的高危孕妇，由于错过了绒毛活检和羊膜腔穿刺的时机，脐血管穿刺成为唯一选择。本文回顾性分析619例高危孕妇脐血穿刺产前诊断资料，探讨其临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2015年6月—2016年12月在福建省妇幼保健院产前诊断中心行脐血穿刺产前诊断的高危孕妇共619例，年龄20～43岁，孕周≥24周，脐血穿刺指征主要包括：胎儿超声异常(包括结构异常和超声软指标异常，如心室强回声点、侧脑室增宽、肠管回声增强等)、血清学筛查高风险、高龄(孕妇预产年龄≥35岁)、羊水异常核型鉴别、染色体异常儿妊娠史、无创性产前基因检测高风险、TORCH感染、夫妻双方同型地贫基因携带等。

1.2 脐血染色体检查

在超声引导下经腹行脐静脉穿刺术，抽取脐血2.5ml，其中1.5ml按照常规方法进行细胞培养、收获、制片、显带及核型分析，另外1ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管冷藏备用。核型结果根据ISCN 2015命名。所有孕妇术前常规遗传咨询并签署脐血穿刺知情同意书。

1.3 分子遗传学诊断

对于胎儿超声发现异常，常规染色体核型分析未见异常或不能明确诊断的样本，家属知情同意后行产前液相芯片(BoBs)( Illumina公司，美国)或单核苷酸多态性微阵列(SNP array)(Affymetrix 750K，USA)检测。

1.3.1脐血DNA提取使用DNA提取试剂盒(Qiagen公司，德国)提取基因组DNA，并用微量分光光度计测定DNA浓度和纯度。

1.3.2产前BoBs检测使用染色体非整倍体和基因微缺失检测试剂盒(Perkin Elmer公司，美国)检测染色体变异，按照操作手册完成检测[2]。

1.3.3 SNP array检测按照Affymetrix 750K基因芯片操作手册进行DNA的消化、扩增、纯化、片段化、标记信号、杂交、洗片染色及扫描等步骤。采用Agilent Genomic Workbench 7.0.4.0软件、Chromosome Analysis Suite(ChAS)软件对数据进行分析判断。拷贝数变异的报告阈值为缺失≥200 kb，重复≥500 kb。

1.4 随访

依据住院分娩病历及电话随访妊娠结局。

2 结果

2.1 穿刺及细胞培养情况

穿刺成功率100%。6例培养失败，培养成功率99.0%(613/619)，胎儿丢失率0.3%(2/619)。均符合我国产前诊断行业规定[3]。

2.2 不同指征异常核型检出情况

脐血穿刺指征主要为胎儿超声异常、胎儿超声异常合并高龄或血清学筛查高风险、高龄、血清学筛查高风险。在培养成功的613例样本中，具有单一诊断指征539例，检出异常核型43例(8.0%)，同时具有2种指征74例，检出异常核型10例(13.5%)。见表1。

表1　不同诊治指征异常核型检出情况[例(%)]

a5例细胞培养失败，已除外；b1例细胞培养失败，已除外；c1例为嵌合型21-三体

2.3 检出的异常核型分类情况

共检出染色体异常核型53例，异常率8.6%(53/613)。染色体数目异常25例，包括21-三体18例，18-三体3例，13-三体1例，性染色体数目异常3例。染色体结构异常19例，包括平衡易位4例，倒位11例，其他[46,XY,20q+dn、46,XX,15cenh+、46,XY,21pstk+、46,XY,del(17)(?p11.2p11.2)]4例，嵌合体异常9例。见表2。

2.4 分子遗传学诊断结果

9例样本进一步行分子遗传学检测，其中5例含致病性变异，分别是DiGeorgeⅠ异常、19号染色体q13.42q13.43区域出现4.3Mb重复、17号染色体p11.2区域出现4.8Mb缺失、12号染色体p11.21-q12区域出现11Mb重复、Y染色体多处重复合并缺失，大小15.3Mb。

2.5 妊娠结局

共随访染色体异常胎儿53例。妊娠结局见表2。

表2　53例核型异常类型及妊娠结局(例)

-表示未进一步诊断；随访情况中部分为超声表现

3 讨论

介入性产前诊断是目前公认的染色体异常的确诊方法。与绒毛、羊水相比，脐血具有培养时间短、方法简便、染色体制备容易的优点，但脐血穿刺术的风险及难度均高于绒毛取样及羊膜腔穿刺术，因此需要严格掌握手术适应证，在有经验的临床及超声医师共同协助下完成。对于错过了绒毛、羊水等诊断时机的高危孕妇，脐血穿刺产前诊断就显得尤为重要。

本研究中检出染色体异常核型8.6%，与卢守莲等[4]的报道(9.4%)接近，低于我们既往报道的14.3%[5]，可能因为样本量的差异及穿刺指征内部构成比不同。在检出的53例异常核型中，21-三体仍然是妊娠中晚期最常见的异常核型，与其他学者研究结果一致[4]。超声检查是产前诊断的重要组成部分，分析脐血穿刺指征的构成比发现，619例样本中单纯超声异常占71.5%，算上超声异常合并其他高危因素则达85.5%，说明超声异常是妊娠中晚期脐血穿刺的主要指征[5-6]。超声发现的异常不仅包括胎儿结构异常，还包括如心室强回声点、侧脑室扩张、肠管回声增强、淋巴水囊瘤等异常软指标。有研究发现，单个超声软指标阳性，染色体异常率为2%～3.5%[6-7]，但同时合并超声结构异常或多个软指标异常，或同时合并其他高危因素时，染色体异常几率明显增高[8-9]。本研究中，单纯超声异常组染色体异常率为6.4%，而合并有其他高危因素时染色体异常率达13.5%，也证明了这一理论。因此，对于妊娠中晚期超声提示胎儿异常，尤其是多发异常，应行介入性产前诊断。此外，高龄和血清学筛查高风险也是染色体异常的高危因素。国际妇产科协会建议将≥35岁的妊娠称为高龄妊娠，而高龄妊娠造成胎儿遗传缺陷的的原因是随着年龄增长而发生的母体卵母细胞的老化等[10]。由于本中心同时开展多种筛查及诊断技术，能够对高危孕妇及早干预，因此这两类高危人群仅占构成比的4.7%和3.1%。但同时应注意，高龄组核型异常率(10.3%)高于总体异常率(8.6%)，而血清学筛查高风险组脐血检出的1例为21-三体。可见，脐血穿刺为确诊染色体异常的有效补救措施。

近年来，各种分子遗传学筛查和诊断技术不断涌现并应用于产前诊断。无创性产前基因检测技术就是其中之一，其利用母血清中胎儿游离DNA(cell- free fetal DNA，cffDNA)进行胎儿染色体非整倍体(21、18、13、X)检测，被认为是一种“近似诊断的筛查”。有学者[11]汇总相关文献后认为：21、18、13三体的检出率分别为99.0%、96.8%、92.1%，X单体检出率也达88.6%。也有不一致的报道，认为21-三体的真阳性率只有93%，性染色体则不足50%[12]，胎盘嵌合、母体嵌合体、孕周、母血中胎儿游离DNA含量等均可能导致假阳性结果[13-14]。本研究中，无创性产前基因检测高风险组病例较少，且有4例提示性染色体异常均为假阳性，故异常率较低。产前BoBs技术、SNP array技术，特别是SNP array技术，通过对拷贝数变异的检测，能够发现染色体的微小缺失和重复，相比传统的核型分析技术，具有高通量、高分辨率、快速等优点，不仅可以提高染色体异常的检出率，还能明确异常片段的来源及致病性[15-16]。本研究中，9例样本进一步行分子遗传学检测，5例发现致病性异常。1例核型为46,XN,inv(9)，超声提示胎儿心脏畸形：法洛四联征，产前BoBs检测提示DiGeorge Ⅰ综合征(22q11.2微缺失)，明确了致病原因。1例血清学筛查高风险病例，核型为46,XY,20q+dn，属多态性改变，一般不具有临床效应，不引起表型异常，而进一步行SNP array检测，发现19号染色体q13.42q13.43微重复，可能致病。1例核型提示17号染色体存在缺失，而SNP array检测明确为17p11.2微缺失。另2例为标记染色体嵌合，通过SNP array检测明确了来源及致病性，最终孕妇夫妇决定终止妊娠。另外4例分子遗传学检测未发现异常病例(2例孕妇高龄，胎儿核型为新发染色体平衡易位；1例超声提示多发软指标异常，核型为多态改变；1例孕妇高龄，超声提示胎儿右锁骨下动脉迷走，核型为嵌合体异常)，随访婴儿表型均正常。然而，近年来研究认为，染色体多态性、平衡易位等与生殖异常关系密切[17-18]，因此，对于出生后表型正常的婴儿也应当延长随访年限。

脐血穿刺是必要、安全可靠的产前诊断技术之一，可以满足大孕周高危孕妇产前诊断的需要，对于脐血穿刺发现的胎儿染色体异常，应结合超声及孕妇夫妇外周血染色体检查，必要时行分子遗传学诊断，从而为临床咨询医生提供更多理论依据，并准确评估下次妊娠再发风险，对出生缺陷的干预具有重要意义。

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