亚麻AtCesA1基因过表达载体的构建

刘岩

（1.东北林业大学，哈尔滨150040；2.黑龙江省农业科学院经济作物研究所，哈尔滨150086）

亚麻AtCesA1基因过表达载体的构建

刘岩1，2

（1.东北林业大学，哈尔滨150040；2.黑龙江省农业科学院经济作物研究所，哈尔滨150086）

为开展纤维素合成酶基因导入亚麻的基因工程研究，以拟南芥为材料克隆了纤维素合成酶基因AtCesA1，序列长为3912 bp，其中编码区在277～3523碱基之间，共3246 bp，推测其编码了1082个氨基酸。通过同义突变将全长基因克隆到植物表达载体pBI1301中，构建出植物表达载体pCAMBIA1301－AtCesA1，经酶切和PCR鉴定确认目的基因已经正确地插入到载体上，为下一步AtCesA1遗传转化亚麻功能研究打下了基础。

亚麻；纤维素合成酶基因；克隆；表达载体

1 前言

纤维作物亚麻（Limum usitatissimum）是人类最早使用的天然纺织材料之一，距今已有一万多年的历史。亚麻这种天然纤维珍贵稀有，仅占天然纤维总含量的1.5%。植物纤维中的主要成分就是纤维素，亚麻中纤维素占其纤维总量的67.07%［1］。纤维素是以D－葡萄糖为原材料，通过β－1，4糖苷键组成的大分子多糖。纤维素合成酶是合成纤维素过程中的关键酶，经过催化合成出β－1，4糖苷链，在合成纤维素的过程中起到至关重要的作用。拟南芥是公认的模式植物，拟南芥纤维素合成酶基因参与次生细胞壁的形成，这一论断为改良亚麻纤维的品质奠定了理论基础［2］。近年来，经过研究拟南芥纤维素合成酶发现，拟南芥纤维素合成酶基因1、2、3、6在合成初生细胞壁的过程中起着举足轻重的作用［3－6］.因此，通过AtCesA1基因的克隆、测序与构建其正义植物表达载体，为利用农杆菌介导法将AtCesA1基因导入亚麻，进而对改善亚麻纤维素质量和产量具有十分重要的意义。

2 材料与方法

2.1 试验材料

植物材料：模式植物拟南芥叶片；植物表达载体：pBI1301（黑龙江省农业科学院经济作物研究所提供）；pGET－T载体（Promega），RNaseA（Takara）、TaqDNA聚合酶（Promega）；IPTG、X－gal、氨苄青霉素、卡那霉素、羧苄青霉素（Promega）、HF109－EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（原平皓），qPCR迷你套装III（TOYOBO）。所有引物及测序在哈尔滨赛信生物科技开发有限公司合成。

2.2 试验方法

2.2.1 RNA提取

取拟南芥叶片，迅速放入液氮中研磨成粉末状，按照原平皓公司的HF109－EASYspin植物RNA快速提取试剂盒的操作提取并纯化RNA。

2.2.2 RT反转录及双链cDNA的合成

拟南芥双链cDNA的合成采用的是TOYOBO公司的qPCR迷你套装III完成。

2.2.3 PCR反应

根据Genbank已发表的纤维素合成酶基因AtCesA1序列，以双链cDNA为模板进行PCR反应。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃30 s，68℃3 min 35个循环，72℃延伸7 min。

2.2.4 胶回收

100μL PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。待目标带分离较好时，用洁净刀片切下目标条带所在胶块，尽量切去多余的胶（紫外灯30 s内，防止DNA变性），置于灭菌的1.5 mL离心管中。用Agarose Gel DNA Extraction Kit试剂盒回收目标带。

2.2.5 基因的克隆与测序

在PCR扩增的过程中，TaqDNA聚合酶具有在双链DNA 3′末端加上一个非模板来源的核苷酸A的特性，使扩增产物具有A突出末端。将PCR产物与T载体连接，转化大肠杆菌DHα菌株，蓝白斑筛选，质粒提取，酶切鉴定片段大小后测序。

2.2.6 植物表达载体的构建

按步骤进行cDNA的PCR扩增，PCR产物的回收，连接，酶切，感受态细胞制备，质粒DNA的提取，连接、转化以及琼脂糖凝胶电泳分析［7］，构建的植物表达载体命名为pCAMBIA1301－AtCesA1。

3 结果与分析

3.1 RNA的提取与cDNA的合成

利用赛信生物公司的HF－EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提取的RNA的电泳图（如图1），主带清晰完整，说明RNA质量较好，可以用于合成双链cDNA。取上述RNA用qPCR迷你套装III合成双链cDNA，合成产物在0.8%的琼脂糖凝胶中电泳，电泳图（图2）呈现一条弥散的亮带，符合植物双链cDNA的带谱特点。

图1 RNA电泳图谱Fig.1 RNA electrophoresismap

图2 cDNA的合成图谱Fig.2 Synthesismap of cDNA

3.2 纤维素合成酶基因的克隆与测序

根据Genbank已发表的纤维素合成酶基因AtCesA1序列，以双链cDNA为模板进行PCR反应，反应条件为：94℃预变性5 min，94℃30 s，68℃3 min 35个循环，72℃延伸7 min。回收PCR产物，按照pGET－T载体试剂盒操作流程，将回收的DNA片段连接到T－载体上，转化大肠杆菌DHA菌株，蓝白斑筛选，质粒提取，酶切鉴定片段大小后测序。

以双链cDNA为模板进行PCR，产物在0.1%的胶中电泳，在4000 bp左右大小处有一条亮带（图3），该基因片段具有开放的阅读框，编码区在277～3523碱基之间，编码区为3246 bp，经过计算推测编码1082个氨基酸，将其与典型的植物纤维素合成酶基因进行比较，其结构有如下特点，具有纤维素合成酶共有的保守区D，D，DQXXW保守区，锌指／LIM转录因子区，高变区，跨膜区（图4），确认3912 bp的DNA片段为一个全长纤维素合成酶基因AtCesA1，NM_119393是其在Genbank的注册号。

图4 纤维素合成酶基因AtCesA1的结构Fig.4 Structure of cellulose synthase gene AtCesA1

图3 纤维素合成酶基因编码区的克隆谱图Fig.3 Coding region’s cloningmap of cellulose synthase gene

3.3 AtCesA1基因正义植物表达载体的构建

为了切除GUS基因，使整个植物表达载体缩小，从而利于下一步的遗传转化，目的序列替换掉该载体上的GUS基因，可以利用35 S promoter作为启动子，目的序列两端的酶切位点分别为5′端NcoI／3′端PmlI。构建好的表达载体pCAMBIA1301－AtCesA1的结构图如下：

图5 AtCesA1基因植物表达载体pCAMBIA1301－AtCesA1的结构图Fig.5 Structure of AtCesA1’s expression vector pCAMBIA1301－AtCesA1

3.4AtCesA1基因植物表达载体的鉴定

将AtCesA1基因表达载体质粒DNA双酶切后电泳出现如下电泳图谱（图6），出现两条带谱，一条超过8.0 kb，一条为1.5 kb左右，符合预期结果。用基因的两端引物进行PCR检测也能扩增出3912 bp的亮带（图7）。证明全长基因AtCesA1基因整合到植物表达载体pBI1301中。

图6 植物表达载体pCAMBIA1301－AtCesA1的双酶切电泳图Fig.6 Double enzyme electrophoresismap of plant expression vector pCAMBIA1301－AtCesA1

图7 AtCesA1植物表达载体的PCR鉴定 Fig.7 PCR identification of AtCesA1’s expression vector

4 讨论

亚麻是世界上最古老的纤维作物之一，亚麻纤维是我国五大麻纺原料之一，其品质和价值与苎麻相仿，优于黄麻、红麻和大麻。亚麻纤维强度是棉花纤维的1.5倍，是绢丝的1.6倍，主要用于纺纱织布。提高亚麻纤维素含量，进而为提高亚麻品质，培育高纤亚麻品种具有重要意义。近年来，有关植物纤维素合成酶CESA的生物途径、调控机制及其一系列编码基因已被阐明，纤维素合成酶基因CESA对于提高纤维作物的品质具有重要意义。目前，亚麻组织培养、分子标记、转基因技术等在国内外已得到了广泛应用，转化效率得到了显著提高，这些都为纤维素合成酶基因AtCesA1遗传转化亚麻奠定了基础。

本研究从模式植物拟南芥中克隆得到了纤维素合成酶基因AtCesA1，并且构建了该基因全长的正义表达载体，为下一步利用农杆菌介导法将纤维素合成酶基因导入亚麻，进而改善亚麻纤维质量及提高亚麻纤维产量奠定了基础。

［1］龙德树，杨传强，曾宪庆，等.亚麻和胡麻纤维的性能研究［J］.纺织学报，1999，20（3）：136－139

［2］孟成生，王志伟，张俊红，等.棉花与拟南芥纤维素合成酶基因家族的生物信息学比较［J］.贵州农业科学，2012，40（7）：39－41.

［3］尉芹，马希汉.魔芋开发利用研究综述［J］.西北林学院学报，1998，13（3）：62－67.

［4］柏巧明，何波，陈建华，等.魔芋属药植资源的研究［J］.湖北农学院学报，2000，20（3）：213－214.

［5］刘红.魔芋的药用研究进展［J］.湖北民族学院学报：医学版，2002（3）：35－37.

［6］林庆华，冯丽霞，黄天文.魔芋的药用价值及应用态势［J］.实用中医内科杂志，2003，17（4）：259.

［7］Samb rook J，Fristch E F，Mantiatis T.Molecular Clonging：A Laboratory Manual.Beijing Science Press，1996.

Cellulose Synthase Gene AtCesA1’s Expression Vector Construction of Transform ing Flax

LIU Yan1，2
（1.Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.Industrial Crops Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150086，China）

In order to introduce cellulose synthase gene into flax by agrobacterium mediated method，the cellulose synthase geneAtCesA1 was cloned from Arabidopsis thaliana.Sequence analysis showed that the coding region was located between the 277－3523 base，a total of3246 bp，which presumably encoded 1082 amino acids，and the total length of cellulose synthase gene was 3912 bp.The full lengthAtCesA1 cDNA was subcloned into pBI1301 by synonymy mutation，constructing a higher plant expression vector pCAMBIA1301－AtCesA1.The construction of the vectorwas verified by enzyme digestion and PCR identification，which can lay a foundation for further research on the function ofAtCesA1 gene transformation.

flax；cellulose synthase gene；clone；expresstion vector

S563.2

A

1671－3532（2017）02－0057－04

2016－09－26

哈尔滨市科学技术局科技创新人才（2013RFQYJ034）；黑龙江省农业科技创新工程（2014QN020）；国家麻类产业技术体系（CARS－19－S03）

刘岩（1983－），男，助理研究员，在读博士研究生，从事亚麻遗传育种研究。E－mail：sharpen1983＠163.com