肉桂水提取物对重型颅脑损伤大鼠脑细胞凋亡、IL-6的影响

董菲菲 潘宇政 彭玲玲 邓淑蓉 张 慧

广西医科大学第一附属医院 广西壮族自治区南宁市 530021

肉桂水提取物对重型颅脑损伤大鼠脑细胞凋亡、IL-6的影响

董菲菲 潘宇政 彭玲玲 邓淑蓉 张 慧

广西医科大学第一附属医院 广西壮族自治区南宁市 530021

目的：通过观察肉桂水提取物对重型颅脑损伤大鼠脑细胞凋亡、血清白细胞介素(interleukin，IL)-6的影响，探讨肉桂对重型颅脑损伤脑组织的保护作用。方法：54只SD大鼠随机分为三组，根据Feeney′s自由落体打击造模法复制动物模型。于伤后6h灌胃。灌胃后24h、72h、168h分别通过TUNEL法、ELISA法检测脑细胞凋亡、血清IL-6的含量。结果：（1）重型颅脑损伤大鼠受伤后血清IL-6明显升高，持续至168h。用肉桂水提取物干预后，在72h明显加重血清IL-6的升高，而在168h可以抑制血清IL-6的升高。（2）重型颅脑损伤大鼠在受伤后存在明显的脑细胞凋亡，这种凋亡一直持续至168h。用肉桂水提取物干预后，在72h明显加重这种凋亡，而在168h可以改善脑细胞凋亡。其作用与IL-6的含量相关。结论：肉桂水提取物对重型颅脑损伤早期用药会加剧炎症反应和细胞凋亡，三天后用药则呈现明显的保护作用。

肉桂；重型颅脑损伤；脑细胞凋亡；IL-6

中药肉桂系樟科植物肉桂的干燥树皮，性辛、甘、大热，归肾、肝、心、脾经，具有补火助阳，散寒止痛，温通经脉等功能；主要用于阳虚、寒凝瘀滞等病症的治疗[1]。当代有人发现，肉桂水提液对非创伤性缺血性脑损伤具有一定的保护作用[2]，可以通过提高神经因子的表达，从而促进慢性脑缺血后脑组织损伤修复过程[3]。然而这些研究主要是观察肉桂对缺血性脑损伤的保护作用，对创伤性颅脑损伤的保护作用还未见研究报道。为此，本实验通过炎症反应介质IL-6和细胞凋亡等指标，观察肉桂对重型颅脑损伤脑组织修复的保护作用。

1 实验材料及仪器

1.1 主要药品、试剂及仪器

肉桂（产于广西）购于广西医科大学第一附属医院中药房；TUNEL试剂盒购自于Roche公司； ELISA试剂盒购自欣博盛生物科技有限公司，编号∶ERC003。改良的Feeney’s 自由落体打击装置；Multiskan FC酶标仪（塞默飞世尔仪器有限公司生产）；高速冷冻离心机（英国生产，型号：英泰TDL5M）；正置荧光相差显微成像镜（型号：BΧ53+DP73+cellsens）

1.2 实验动物、动物分组及给药

SPF级雄性SD大鼠56只，体质量（230±20）g，购自于广西医科大学实验动物中心,许可证号∶SCΧK(桂)2014-0002。SD大鼠随机分成A组（正常对照组）﹑B组(模型组)﹑C组（肉桂水提取物组）三组，每组各18只。给药组在造模后6h予肉桂水提取物灌胃，剂量用成人每日常用量5g，换算成大鼠剂量，计算方法依据徐淑云药理实验方法学公式计算【剂量=(成人的用量×换算系数0.018×3.16倍)/2】，正常对照组与模型组分别在伤后6h以等量生理盐水灌胃，各组灌胃均每日1次，连续7天。

1.3 重型颅脑损伤模型制备

根据文献[4]建立模型。于造模6h后，参照有相关文献[5]对每只动物行神经功能缺损评分，评分标准参照《现代药理实验方法学》[6]，采用10 分制、单盲法进行评分；＞2 分则说明造模成功，＜2 分则剔除。

1.4 标本采集及检测

1.4.1 标本采集

各组分别在造模后第24、72、168h三个时间段取材，每组每个时间段随机取6只大鼠。（1）以心脏采血法采血3mL，4℃，2200 r/min离心15min，取上清液，置-80℃冰箱待测IL-6。（2）经升主动脉灌注250mL的0.9%氯化钠注射液，直至从右心房流出的液体变清亮为止，再灌注4%多聚甲醛液250mL，断头取脑，并迅速浸入4%多聚甲醛液中，固定24h后修成4mm块，常规酒精脱水、石蜡包埋待测脑细胞凋亡。

1.4.2 脑细胞凋亡检测

以TUNEL原位法检测损伤区凋亡细胞，严格按试剂盒说明步骤进行检测。每组6只大鼠分别选同一冠状层的切片在高倍镜下观察，细胞核中出现棕黄色的为阳性细胞，8 个高倍视野计数TUNEL阳性标记细胞，计算凋亡阳性细胞百分比，阳性率=阳性细胞数/（阳性细胞数+ 阴性细胞数）×100%。

1.4.3 血清IL-6检测

采用ELISA法检测，严格按照试剂盒说明书步骤进行检测。最后使用酶标仪450nm波长按顺序测量各孔的浓度值。

1.5 统计学处理

2 结果

表1：各组血清IL-6含量（±s，pg/ml）

表1：各组血清IL-6含量（±s，pg/ml）

与A组比较，#P＜0.05；与同时间段B组比较，*P＜0.05；与同组168h比较，△P＜0.05

组别N24h72h168h A组1851.03 ±23.7651.02 ±24.3650.03 ±13.76 B组18142.23±52.32#126.53±34.74#102.82±34.50# C组18141.67±6.99#△275.80± 98.67#*△60.09±17.65*

表2：各组脑组织TUNEL细胞凋亡率（±s，%）

表2：各组脑组织TUNEL细胞凋亡率（±s，%）

与A组比较，#P＜0.05；与同时间段B组比较，*P＜0.05；与同组168h比较，△P＜0.05

组别N24h72h168h A组189.44 ± 2.8610.05± 3.1210.25± 2.90 B组1874.75±10.13#68.55±11.46#68.23± 5.46# C组1872.84±6.90#△81.14± 6.86#*△39.74± 12.26#*

2.1 血清IL-6含量

结果见表1。B、C组与A组比较，血清IL-6含量明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。C组在72h与B组比较，C组IL-6含量明显高于B组。C组在168h与B组比较，C组IL-6含量明显低于B组。C组在168h时间段与24h、72h两个时间段比较有差异。B组各时间段比较，无明显差异（P＞0.05）。这些结果提示，重型颅脑损伤大鼠受伤后外周血血清IL-6明显升高，一直持续至168h。用肉桂水提取物干预后，在24h无变化，在72h血清IL-6水平明显升高，而在168h血清IL-6水平明显下降，接近正常组水平。

2.2 脑组织TUNEL细胞凋亡率

结果见表2。B、C组与A组比较，脑细胞凋亡率明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。C组在72h与B组比较，C组明显高于B组。C组在168h与B组比较，C组明显低于B组。C组在168h时间段与24h、72h两个时间段比较有差异。B组各时间段比较，无明显差异（P＞0.05）。这些结果提示，重型颅脑损伤大鼠在受伤后存在明显的脑细胞凋亡，这种凋亡一直持续至168h。用肉桂水提取物干预后，在24h凋亡无变化，在72h凋亡加重，而在168h脑细胞凋亡则比模型组明显下降。

2.3 血清IL-6水平与脑细胞凋亡的关系

结果见图1。C 组血清IL-6水平与脑细胞凋亡率相关关系Pearson 的系数r = 0.816，P = 0.000（双侧）。其他各组血清IL-6水平与脑细胞凋亡率无相关关系。结果显示C组血清IL-6水平与脑细胞凋亡率有正相关关系。

3 讨论

重型颅脑损伤早期都存在继发炎症反应，这一炎症反应是导致脑损伤的主要机制之一[7，8]。IL-6 在炎症反应中扮演着重要角色，Marklund等人[9]认为IL-6在损伤发生后即刻就上升，而且损伤程度越严重，血中IL-6的含量就越高，IL-6含量与脑损伤程度呈正比。本研究发现，重型颅脑损伤大鼠受伤后外周血血清IL-6即明显升高，这一现象一直持续至第168h。结果与Marklund等人的研究结果基本一致。说明颅脑损伤后一周内一直存在明显的炎症反应。用肉桂水提取物干预后，在72hIL-6水平比模型组明显升高，而在168h IL-6水平则明显降低，接近正常水平。这说明颅脑损伤早期（72h内）用药，肉桂会加剧颅脑损伤的炎症反应，从而加重脑组织损伤。而72h后用药则能够抑制颅脑损伤的炎症反应，呈现保护脑细胞的作用。

研究表明，颅脑损伤导致的脑细胞损害除了直接损伤引起的脑细胞死亡外，还存在继发的细胞凋亡[10-12]。张剑涛[13]等人报道颅脑损伤伤灶周围额皮质在4h后即开始出现脑细胞凋亡现象，以后凋亡细胞逐渐增加，至3d达高峰，之后有所下降。脑细胞凋亡的原因很多，但颅脑损伤继发的炎症反应可能是重要原因之一。实验中观察到，重型颅脑损伤大鼠在受伤后存在明显的脑细胞凋亡，一直持续到168h。用肉桂干预后，脑细胞凋亡在早期明显加剧，而在72h后明显减少细胞的凋亡。细胞凋亡的趋势与炎症反应重要指标IL-6水平的变化趋势基本一致。这表明颅脑损伤早期用药，肉桂会加剧炎症反应，以致加重脑细胞的凋亡，而72h后用药则可以抑制炎症反应，从而减轻脑细胞凋亡，起到保护脑细胞的作用。

肉桂对颅脑损伤炎症反应和细胞凋亡的影响机制还不是很清楚。可能与肉桂通过抑制炎症因子降低脑水肿有关。细胞因子炎症反应可加重脑水肿、脑组织缺氧使得中枢神经系统进一步遭受损害[14]。有人发现肉桂水提物通过减轻缺血区脑组织水肿而明显降低脑含水量，而对缺血性脑损伤具有一定的保护作用[2]。杨小锋[15]等人提出，脑组织凋亡细胞数与颅内压、脑组织含水量在不同时期呈正相关, 在总体的变化过程中也有正相关性。

图1

（通讯作者：潘宇政）

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国家自然科学基金（NSFC.81460687），广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项（GZLC14-29）。

董菲菲（1990-），女，硕士研究生。

潘宇政（1961-），男，硕士生导师。