胃窦肌间Cajal间质细胞自噬研究伴抑郁的FD发病机制

2017-04-17 13:06曾丽君凌江红张丽敏王煜姣
现代养生·下半月 2017年2期
关键词:肌间胃窦功能性

曾丽君 凌江红 张丽敏 王煜姣 邓 静

广西医科大学第一附属医院 广西壮族自治区南宁市 530021

胃窦肌间Cajal间质细胞自噬研究伴抑郁的FD发病机制

曾丽君 凌江红 张丽敏 王煜姣 邓 静

广西医科大学第一附属医院 广西壮族自治区南宁市 530021

目的:分析基于胃窦肌间Cajal间质细胞(Myenteric Interstitial Cells of Cajal,ICC-MY)自噬研究伴抑郁的功能性消化不良(Functional Dyspepsia,FD)的发病机制。方法:20只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组,每组10只。模型组采用慢性夹尾激惹刺激法制备FD大鼠模型。透射电镜观察两组大鼠胃窦肌间Cajal间质细胞内自噬体数量;免疫荧光法检测两组ICC-MY内Beclin1、微管相关蛋白1轻链3 B( microtubule-associated protein 1 light chain 3B,LC3B)蛋白的荧光强度。结果:与正常对照组比较,模型组大鼠胃窦ICC-MY内自噬体数量多,Beclin1、LC3B蛋白的荧光强度显著升高(均P=0.000)。结论:伴抑郁的FD的发病机制可能与抑郁引起胃窦ICC-MY过度自噬有关。

功能性消化不良;抑郁;肌间Cajal间质细胞;自噬

功能性消化不良(Functional Dyspepsia,FD)系指上腹不适症状如腹痛、腹胀、早饱、恶心等反复发作,且经检查排除器质性、系统性、或代谢性疾病的一组症侯群,胃动力下降是其主要病理基础之一。临床观察发现,FD患者多伴有抑郁状态[1,2],其中尤以动力障碍样FD亚型抑郁情绪最多见[3],此外54%抑郁症患者均有消化道不适的主诉,部分患者甚至达到FD的诊断标准[4],且研究已经证实精神心理因素尤其是焦虑、抑郁是FD的促发因素[5],但对于抑郁与FD的发病之间的具体关系尚不清楚。

肌间Cajal间质细胞(Myenteric Interstitial Cells of Cajal,ICC-MY)分布于胃肠道环形肌及纵行肌之间,产生慢波电位,是胃肠道的起搏细胞,调节胃肠道的运动,其中分布于胃窦的ICC-MY是胃电生理活动的起搏细胞,对维持胃慢波起着广泛性的决定作用。Cajal间质细胞(Interstitial Cells of Cajal,ICC)的自噬或凋亡等引起胃肠道起搏电位、慢波节律等异常,是多种胃肠疾病发生的关键机制[6]。研究发现抑郁等不良情绪可激发细胞自噬[2],而细胞过度自噬将导致细胞死亡[7,8]。在此基础上我们假说FD胃动力下降是否与抑郁引起胃起搏细胞ICC-MY过度自噬甚至细胞死亡有关。因此本实验将以ICCMY为观察对象,观察伴抑郁的FD大鼠胃窦ICC-MY内自噬的情况。

1 材料

1.1 动物

健康SPF级SD大鼠20只,雌雄各半,体重200g左右,由广西医科大学动物实验中心提供,实验动物合格证号:scxk桂2009-0002。

1.2 主要试剂

c-kit山羊抗大鼠多克隆抗体(Santa Cruz,USA),Beclin1兔抗大鼠多克隆抗体(Thermo Fisher,USA),LC3B兔抗大鼠多克隆抗体(Thermo Fisher,USA),四甲基异硫氰酸罗丹明(Tetramethyl Isothiocyanate Rhodamine,TRITC)-驴抗山羊多克隆抗体(Santa Cruz,USA),异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)-山羊抗兔多克隆抗体(Life,USA),4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)工作液(北京索莱宝公司)。

2 方法

2.1 动物分组与FD模型建立

将20只SD大鼠随机分成2组:正常对照组、模型组,每组10只。模型组按张钰琴等[12]采用慢性夹尾激惹刺激法造模。模型组大鼠随机每5只大鼠1笼,使用纱布包裹止血钳,钳夹鼠尾中后1/3,待大鼠出现尖叫、撕打等激惹表现后立即松开止血钳,30min/次•笼,2次/d,间隔12h,持续4周。

2.2 取材

图1:ICC-MY特异性c-kit蛋白的表达(Nikon,×400)

末次给药12h后用10%水合氯醛以0.3ml/100g的剂量腹腔注射麻醉大鼠,剖腹取胃,剪取距离幽门0.5cm处大小约3mm×3mm及5mm×10mm[13]的胃窦组织,立即用生理盐水漂洗干净,分别快速固定于5%戊二醛及4%多聚甲醛中留待后续检测。

2.3 透射电子显微镜观察胃窦ICC-MY内自噬体的表达

固定于5%戊二醛的胃窦标本经前固定、漂洗、后固定、漂洗、块染、脱水、浸渍后包埋成块,65℃恒温箱中36h,光镜下半薄切片定位ICC-MY,确定位置后超薄切片机切片,透射电子显微镜观察ICC-MY内自噬体。

2.4 激光扫描共聚焦显微镜观察两胃窦ICC-MY内C-kit、Beclin1、LC3B蛋白表达

固定于4%多聚甲醛中的胃窦标本经梯度酒精脱水、石蜡包埋,切片机切片,65℃烤片3h,二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水,清洗,抗原修复,清洗,0.1%硼氢化钠室温封闭,清洗,滴加山羊血清封闭,弃去山羊血清,分别滴加一抗(c-kit抗体浓度为1∶50; Beclin1、LC3B抗体浓度均为1∶100)4℃过夜;17h后37℃温箱复温30min,清洗,分别滴加二抗(TRITC、FITC多克隆抗体浓度为1∶100),37℃温箱避光孵育90min,清洗,DAPI染核2min,充分清洗后滴加抗荧光衰减封片剂封片,以适于TRITC(550nm)、FITC(490nm)及DAPI(360nm)的激发波长来观测标本,c-kit阳性表达荧光为红色,Beclin1、LC3阳性表达荧光为绿色,DAPI染核为蓝色。采用双通道同步扫描,每一标本随机选取5个高倍视野,用Image-Pro Plus6.0软件进行Beclin1、LC3荧光强度分析。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 ICC-MY特异性c-kit蛋白的表达

见图1。c-kit蛋白为ICC的特异性蛋白,分布于细胞膜表面,阳性表达呈红色。如图所示,阳性表达分布于胃窦肌层环形肌及纵行肌之间,代表ICC-MY的位置结构。ICC-MY以团状结构分布,细胞核大,细胞质少。

3.2 ICC-MY内自噬体表达(见图2)

正常对照组ICC-MY内内质网丰富,细胞器结构明显,偶见自噬体;模型组ICC-MY内正常细胞器少见,可见大量自噬体。

3.3 ICC-MY内Beclin1、LC3B蛋白荧光强度(见图3、4,表1)

与正常对照组比较,模型组ICC-MY内Beclin1、LC3B阳性率高,荧光强度升高(均P=0.000)。

表1:两组胃窦ICC-MY内Beclin1、LC3B荧光强度的比较(±s)

表1:两组胃窦ICC-MY内Beclin1、LC3B荧光强度的比较(±s)

注:与正常对照组比较,①P=0.000.

分组nBeclin1LC3B正常对照组1045.96±11.8836.78±11.37模型组1083.64±10.83①75.89±13.34①

图2:胃窦ICC-MY内自噬泡表达情况(日立H7650,×20000)

图3 各组大鼠胃窦ICC-MY内Beclin1表达(Nikon,×400)

图4:各组大鼠胃窦ICC-MY内LC3B表达(Nikon,×400)

4 讨论

随着对于FD发病机制研究的深入,精神心理因素在FD发病中越来越受到重视。临床上使用心理治疗或抗抑郁药物治疗伴抑郁的FD患者发现FD患者不仅抑郁状态得到明显改善,同时可以提高FD的临床疗效和生存质量,胃排空改善,并且FD复发率明显降低[9-12]。本课题组在前期研究[13]中模拟FD的发病机制采用慢性夹尾激惹刺激法复制FD大鼠模型,发现与正常对照组大鼠比较模型组大鼠不仅出现了饮食量下降,体重增长缓慢及胃动力下降等消化不良表现,同时在抑郁测评如糖水消耗实验和敞箱实验中表现出快感缺失、运动及探索行为能力明显下降等抑郁表现,但对抑郁与FD发生的深层机制尚未进行研究。

细胞自噬是真核细胞利用溶酶体对胞质内变性坏死的蛋白质及细胞器进行降解的生物学过程[14],其中涉及到多种蛋白的参与。Beclin1参与自噬前体的形成并引导自噬相关蛋白定位于自噬体上[15,16]。微管相关蛋白1轻链3( microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)蛋白首先会在合成后立即在其羧基端被Atg4所剪切,产生细胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中,LC3-I会被包括Atg7和 Atg3在内的泛素样体系所修饰和加工,产生分子量为14 kD的LC3-II,并定位到自噬小体中,LC3B结合并始终位于胞内自噬体的膜上,其含量与细胞自噬的水平呈正比[17,18]。在正常细胞中,自噬维持在一个较低的水平以保持细胞的自稳态,但严重或快速的细胞自噬将导致细胞自噬性死亡。研究已经证实抑郁可引起细胞发生自噬,尤其在神经系统研究方面进展明显,已有研究证实抑郁症患者尸检时海马区域自噬标志性蛋白Beclin1及LC3表达升高[19],另外在药物导致的长时程抑郁细胞模型组自噬关键蛋白LC3B表达明显升高[20],表明细胞过度自噬与抑郁症的发生相关。本实验结果表明,与正常组比较,模型组大鼠胃窦ICC-MY内自噬体增多,自噬蛋白Beclin1及LC3B表达增多(均p=0.000),提示伴抑郁的FD模型大鼠ICC-MY内发生了过度自噬。因此笔者推测,伴抑郁的FD的发病机制可能是抑郁引起胃起搏细胞ICCMY过度自噬导致其细胞起搏功能缺失,胃慢波活动受阻,胃动力下降。

(通讯作者:凌江红)

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国家自然科学基金资助项目(No.81360544;81560763)。

曾丽君(1990-),女,在读硕士研究生。研究方向为中西医结合消化。

凌江红(1969-),女。博士,教授、主任医师。研究方向为中西医结合消化。

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