不同品系小鼠肺纤维化模型的比较研究*

宋桂芹，徐志伟，李 泽，李向上，张效云

不同品系小鼠肺纤维化模型的比较研究*

宋桂芹1，徐志伟1，李 泽2，李向上2，张效云1

（河北北方学院1.生物化学教研室，2.医学检验学院，河北 张家口 075000）

目的 通过对博来霉素诱导3个不同品系小鼠肺纤维化程度的比较研究，寻找最适合研究肺纤维化的小鼠模型。方法 选用C57BL/6、BALB/c以及KM 3种品系的小鼠，分别设为模型组和对照组。模型组向气管注射博来霉素（5 mg/kg），正常对照组注入等量的生理盐水。3个品系的小鼠分别于造模后的第7天、14天和28天处死8只，观察在不同的时间点肺系数、羟脯氨酸含量的变化以及通过Masson染色观察肺纤维化程度的改变。结果 各模型组不同时间点的肺系数、羟脯氨酸含量和肺组织的病理学改变积分与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；C57BL/6模型组小鼠在不同时间点肺系数、羟脯氨酸含量和肺组织病理学改变积分与BALB/c和KM比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 C57BL/6小鼠对博来霉素反应敏感，肺纤维化明显，是3个品系小鼠中研究肺纤维化的最理想模型。

肺纤维化；博来霉素；小鼠

肺纤维化是一种病因不明的间质性肺疾病，其以弥漫性肺泡炎、成纤维细胞病理性增生和细胞外基质在肺间质及肺泡腔沉积等为其病理特征[1-3]。目前，临床上缺乏有效的治疗手段，病死率极高[4]。纤维化的病变部位主要是肺间质，也可涉及肺血管以及上皮细胞[5]。复制理想的肺纤维化模型是探讨人类肺纤维化的发病机制基本保障，同时也是进行临床上研发肺纤维化治疗药物的基本保证。小鼠具有繁殖快、饲养管理费用低等特点，成为广泛应用于生物医学研究的实验动物，尤其是在生命科学研究中，被应用于肿瘤、免疫、微生物、生殖生理等领域。在有关肺纤维化的一系列科学研究中，小鼠是科研工作者最常选用的动物。但是究竟哪一种品系的小鼠更适合作为肺纤维化的模型，国内外鲜有报道。本研究以KM、C57BL/6及BALB/c 3个品系小鼠作为研究对象，寻找最适合复制肺纤维化模型的小鼠。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 实验动物 清洁级小鼠C57BL/6、BALB/c和KM各48只，6～8周龄，雄性，体重（20±2）g，购自北京大学医学部。标记动物后分笼饲养，温度为18～24℃，光暗周期交替。

1.1.2 主要试剂与器材 博来霉素购自日本化药株式会社，批号640110，羟脯氨酸试剂盒购自南京建成生物研究所，Masson染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，普通光学显微镜，722分光光度计

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将3个品系小鼠各随机分为模型组和对照组，均为24例。

1.2.2 肺纤维化模型制作 各组小鼠称重后，用3.5%水合氯醛注射液腹腔麻醉（0.1 ml/10 g），向各模型组小鼠气管内注入生理盐水溶解的博来霉素（5 mg/kg）0.1 ml，向各对照组小鼠注入等量生理盐水，动物清醒后常规饲养。分别于饲养后的第7、14和28天处死小鼠，分离全肺并除去脂肪组织，生理盐水清洗表面，滤纸吸干多余水份，称全肺湿重，并计算肺系数。取右肺冻于液氮置入-70℃冰箱冷冻保存，用于肺组织羟脯氨酸的测定。左肺经4%多聚甲醛固定后制备石蜡切片，进行Masson 3色染色比较分析研究。

1.2.3 肺组织羟脯氨酸试剂盒测定 肺组织羟脯氨酸的测定采用碱水解法[6]，按照试剂盒说明书操作。

1.2.4 肺系数计算 记录小鼠体重。小鼠处死后分离全肺并去除脂肪组织，生理盐水清洗表面后滤纸吸干多余水分，称全肺湿重并计算肺系数。肺系数=肺湿重（mg）/体重（g）。

1.2.5 小鼠肺组织病理学检查 取右肺下叶于4%多聚甲醛中固定24 h，经脱水、浸蜡和包埋后制作厚度4μm石蜡切片进行Masson染色，在光学显微镜下观察肺组织病理学改变，并且参照SZAPIEL等[7]提出的肺纤维化分级法进行评分。肺纤维化程度的评定标准：0级，无纤维化，积分是0分；1级，轻度纤维化，且面积小于全肺的20%，积分是1分；2级，中度纤维化，且面积占全肺20%～50%，积分是2分；3级，重度纤维化，且面积占全肺50%以上，肺泡结构非常紊乱，积分是3分。通过观察分析得到不同品系的小鼠在不同时间点的肺纤维化程度的总积分，进而求得平均积分（平均积分=总积分/例数）对肺纤维化程度进行半定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较用方差分析，若差异有统计学意义，用SNK法做两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3个品系小鼠的一般情况

3个品系的小鼠中，对照组均表现出精神状态好，饮水和饮食正常，体重都有不同程度的增加。在博来霉素组的不同品系小鼠在造模后不久出现了不同程度的饮食及饮水减少、活动度下降、精神萎靡、毛发干枯及体重下降等情况。BALB/c以及KM在造模后1周左右，大多数小鼠的情况渐渐趋于好转。C57BL/6体重下降最显著，并且在造模后的第9天体重又开始回升并趋于稳定。C57BL/6小鼠在用药后第11天开始出现死亡，至第28天共有3例小鼠死亡。BALB/c以及KM小鼠均无死亡现象。

2.2 3个品系小鼠肺组织羟脯氨酸含量的比较

3个不同品系小鼠的模型组羟脯氨酸含量在第7、14和28天均高于对照组（P＜0.05）；C57BL/6小鼠模型组的羟脯氨酸含量在不同时间点与其他品系小鼠模型组比较，增加更为显著，差异有统计学意义（P＜0.05）；KM、BALB/c小鼠的模型组在不同时间点的HYP含量的差异无统计学意义。见表1。

2.3 3个品系小鼠肺系数的比较

如表2所示，3个不同品系的小鼠的模型组肺系数在第7、14和28天均高于对照组（P＜0.05），C57BL/6小鼠模型组的肺系数与KM、BALB/c小鼠模型组在不同时间点比较，差异有统计学意义（P＜0.05），KM、BALB/c小鼠的模型组在不同时间点的肺系数的比较，差异无统计学意义。

表1 3个品系小鼠羟脯氨酸的含量 （n=24，μg/mg，x±s）

表2 3个品系小鼠肺系数 （x±s）

2.4 3个品系小鼠模型组肺组织的病理学积分的比较

Masson染色评定3个品系小鼠模型组的肺组织病理学积分，各品系小鼠对照组均没有出现肺组织纤维化。C57BL/6小鼠与KM、BALB/c小鼠在不同时间点模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。C57BL/6小鼠模型组的肺组织病理学积分与KM、BALB/c小鼠在不同时间点模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），KM、BALB/c小鼠的模型组在不同时间点的病理学积分的比较，差异无统计学意义。见表3。

表3 3个品系小鼠肺组织纤维化病理学积分 （x±s）

3 讨论

博来霉素是一种从轮生链霉菌中提取的广谱的抗肿瘤的药物，具有引起肺纤维化的副作用[8]。而由博来霉素诱导动物肺纤维化模型的生理学以及病理组织学的发展过程与人类的肺纤维化非常相似，所以博来霉素成为国内外制作肺纤维化模型最常用的药物[9]。在利用博来霉素造模时，可以采用腹腔、静脉、皮下、气管等多种途径给药，但是通过气管给药是制备肺纤维化目前最常用的方法[10]。不同种属的动物对博来霉素诱导肺纤维化的反应程度不同[11]。本实验通过气管注入博来霉素诱导肺纤维化，比较不同品系的小鼠在博来霉素诱导的肺纤维化程度的差异。

肺组织羟脯氨酸的测定、肺系数计算、小鼠肺组织病理学检查是判断肺组织纤维化的主要指标。羟脯氨酸是机体胶原蛋白中的一种特有的组成成分，约占到其氨基酸总量的13.4%，并且几乎所有的羟脯氨酸均存在于胶原中，因此羟脯氨酸的测定能够间接反映肺组织中胶原的含量，以此可被用来评估肺纤维化的程度[12]。肺系数是通过肺湿重（mg）/体重（g）计算得到，因此其数值的高低与肺湿重和体重密切相关。在肺纤维化形成的进程中，炎症细胞的渗出、毛细血管充血、细胞出现肿胀以及胶原纤维的沉积等多种因素均可导致肺湿重增加，进而引起肺系数升高。另外，造模后的小鼠处于疾病状态，体重增长缓慢或者持续下降，也是导致肺系数增加的直接原因[13]。本实验是通过肺组织羟脯氨酸试剂盒测定羟脯氨酸的含量，精确分离小鼠的全肺计算肺系数以及在光学显微镜下观察小鼠组织病理学改变，比较在相同的造模条件下，不同品系的小鼠肺纤维化的变化程度。本实验观察到，造模后第7天、14天和28天，3个品系的模型组小鼠均出现不同程度的肺纤维化，其中C57BL/6模型组小鼠与BALB/c和KM模型组比较，差异具有统计学意义。而KM、BALB/c小鼠的模型组在不同时间点比较，差异无统计学意义。实验结果表明，博来霉素诱导C57BL/6小鼠形成肺纤维化程度明显，是3个品系小鼠中最适合用于复制肺纤维化模型。

KM小鼠是一类繁殖力、抗病力和适应力均很强的远交群小鼠，被广泛应用于药理学、毒理学等多种领域的研究[14]。BALB/c和C57BL/6是两种国内最常用且遗传背景差异较大的近交系小鼠。BALB/c小鼠乳腺癌的发病率较低，其他肿瘤如肺癌、卵巢癌等有一定的发病率，具有对麻疹病毒中度敏感、对放射线极为敏感等特性，被应用于研究肿瘤、核医学等领域。C57BL/6小鼠常被认作是标准的“近交系”，群体反应性比较均一，具有对放射性物质耐受中等、对结核杆菌比较敏感、乳腺肿瘤的自然发病率低以及干扰素产量高等特性，广泛应用于生理学、肿瘤学与遗传学等方面的研究。艾必燕等[15]对C57BL/6小鼠呼吸系统组织进行详细、系统地组织学观察，发现C57BL/6小鼠的呼吸系统组织与人体的呼吸系统的主要差异在于气管腺，肺组织中实质和间质部分组织学结构与人类的差异不大。肺纤维化是一种肺间质的疾病，而C57BL/6小鼠肺组织的组织学结构接近于人类，其作为肺纤维化的模型能够最大程度地模拟人的肺纤维化的发病机制和过程，推测C57BL/6小鼠是制作肺纤维化模型的最佳选择。本研究通过3个品系小鼠造模后的第7天、14天和28天的肺纤维化指标的比较，得出C57BL/6小鼠是3个品系中最适合复制肺纤维化模型的小鼠，与上述推断的结果一致。

选用博来霉素气管给药的诱导方式，选择C57BL/6小鼠复制肺纤维化模型，过程比较简单，可重复性也比较高，且与人的肺纤维化的发病过程和机制比较相似，是良好的肺纤维化模型，不过在整个实验过程中，该品种小鼠的死亡率最高，这也是目前研究中急需解决的问题，并且C57BL/6小鼠易于诱发形成肺纤维的机制值得进一步研究和探讨。

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（张蕾 编辑）

Comparative study on pulmonary fibrosis model induced by Bleomycin in three strains of mice*

Gui-qin Song1,Zhi-wei Xu1,Ze Li2,Xiang-shang Li2,Xiao-yun Zhang1
(1.Department of Biochemistry,2.College of Laboratory Medicine,Hebei North University, Zhangjiakou,Hebei 075000,China)

Objective To find out the most proper model of human pulmonary fibrosis through a comparative study of pulmonary fibrosis in three strains of mice induced by Bleomycin(BLM).Methods C57BL/6,BALB/c and KM mice were randomly divided into model groups and normal control groups,respectively.Three model groups received a single intratracheal instillation of 5 mg/kg body weight of BLM to induce pulmonary fibrosis,while normal control groups were administrated the same amount of normal saline.On the 7th,14th and 28th day,8 mice were respectively sacrificed in each model group.Lung tissues were removed to measure the lung coefficient and hydroxyproline content of the mice at different time points,and Masson staining was used to evaluate the extent of pulmonary fibrosis.Results The lung coefficient,hydroxyproline content and pulmonary histopathological changes of each model group were remarkably different from those of the corresponding normal control group(P＜0.05). Compared with the BALB/c and KM model groups,the lung coefficient,hydroxyproline content and pulmonary histopathological changes of the C57BL/6 model group were significantly increased(P＜0.05).Conclusions C57BL/6 is more suitable for the model of pulmonary fibrosis in the three strains of mice because of sensitive Bleomycin reaction and obvious pulmonary fibrosis.Of the three strains,C57BL/6 is the most suitable model in studying pulmonary fibrosis.

pulmonary fibrosis;Bleomycin;mouse

R-332；R563

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.003

1005-8982（2017）04-0013-04

2016-04-11

张家口市科技局自然科学基金资助项目（No：-12110046D-1）

张效云，Tel：0313-4029270；E-mail：xyzonly928@163.com