一株产脲酶菌株的分离及其固化土壤中Cd2+的研究

王继勇，杨子陆，陈加立，江英杰

(武汉理工大学 化学化工与生命科学学院，武汉 430070)

一株产脲酶菌株的分离及其固化土壤中Cd2+的研究

王继勇，杨子陆，陈加立，江英杰

(武汉理工大学 化学化工与生命科学学院，武汉 430070)

指出了微生物诱导碳酸盐成矿(MICP)技术可有效修复镉污染土壤.从土壤中分离出了一株高效产脲酶菌株，该菌株对10 mg Cd2+/kg模拟污染土壤的Cd2+固化率为67.7 %.X射线衍射(XRD)、能谱分析(EDS)、扫描电子显微镜(SEM) 和红外光谱(IR)等分析显示：产物为碳酸镉和碳酸钙，碳酸盐结晶方式为晶格掺杂.

碳酸盐矿化菌株；碳酸镉

1 材料及方法

1.1 仪器和试剂

SM-IT300型扫描电子显微镜(日本电子株式会社)，Nicolet6-700型傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo)，MD3X射线能谱仪(上海沃埃得)，A360型紫外-可见分光光度计(上海翱艺仪器)，PH10S-E笔式酸度计(上海精密仪器仪表)，GGX-100火焰原子吸收分光光度计(北京海光仪器).

将1 mg干燥样品与100 mg KBr(光谱纯)磨细混匀，压制成片检测.CdCl2·2.5H2O、KH2PO4、NaCl、苯酚红(酚红)、无水乙醇、蛋白胨、葡萄糖、尿素均为AR级，蛋白胨和酵母浸出粉BR级，试剂均购自国药集团化学试剂有限公司.

1.2 实验材料

采集武汉理工大学花木种植园深度5～20 cm处的土壤样本，富集培养后从富集液中分离具有产脲酶能力的菌株，培养24 h后检测菌浓度(OD600)和氨氮含量，选取产脲酶能力最强的菌株.

使用产脲酶菌株筛选分离培养基、生长培养基和LB培养基(配方略).取土壤试样5 kg，去除大颗粒杂质后自然风干，向风干后土壤中加入适量0.5 mo1/L的CdCl2溶液，使土壤中镉含量为10 mg/kg.

1.3 菌株培养与检测

将产脲酶菌株生长培养基在121℃灭菌30 min，从保存产脲酶菌株的LB斜面上挑取部分菌苔，接种到灭菌后的150 mL培养液中，置于150 r/min、37℃的恒温摇床中培养72 h，测量培养液的OD600和pH值，采用二甲氨基苯甲醛显色分光光度法检测培养液中尿素含量[9].菌株产脲酶能力以培养液中氨氮含量计，氨氮含量检测选用苯酚钠-次氯酸钠比色法[10,11].

称取1 g土壤，加入10 mL去离子水，搅拌均匀后放置5 min，检测浸提液的pH值.参照王瑞兴等[12]的实验方法检测土壤中Cd2+含量.

1.4 细菌诱导土壤中Cd2+矿化

在5 kg镉含量为10 mg/kg的模拟污染土壤中，每天加入100 mL 5 mo1/L尿素溶液和100 mL 培养48 h的菌液，每12 h检测1次土壤pH值和Cd2+含量，直至土壤的pH值稳定.选取实验土壤中板结土壤颗粒于60℃干燥2 h后备用.

1.5 土壤中矿化产物的分析

使用SEM、XRD、IR、EDS等技术分析土壤中矿化产物.

2 结果与分析

2.1 产脲酶菌株的生长特性及产酶活性

图1 菌株UR-2的生长曲线及培养中各参数变化Fig.1 Growth curve and various parameter changes of UR-2 strain during cultivation

2.2 产脲酶菌株矿化土壤中Cd2+进程

实验土壤pH值和Cd2+含量的变化见图2.1 d后细菌适应土壤环境并大量繁殖，开始水解尿素，土壤pH值在5 d 内迅速从7.02增至8.35，随着营养物质的消耗，土壤pH值稳定在约8.61(图2a).土壤中Cd2+含量随土壤pH值上升逐渐减小.0～1 d内Cd2+含量基本无变化；1～5 d内，由于尿素的快速水解和土壤pH值升高，Cd2+含量迅速下降并稳定在3.23 mg/kg；10 d后Cd2+固化率为67.7%，说明UR-2对土壤Cd2+具有较强的固化能力(图2b).许燕波等[8]的碳酸盐矿化菌对污染土壤Cd去除率为51%，修复周期为7 d；王瑞兴等[12]的碳酸盐矿化菌A对土壤Cd去除率为75.5 %，修复周期为10 d；故菌株UR-2在镉污染土壤治理中具有一定潜能.

图2 菌株UR-2固化进程中土壤pH及其Cd2+含量变化Fig.2 Content changes of Cd2+ ion and pH changes during soil curing process by urease-producing bacteria UR-2

2.3 矿化产物XRD分析

2θ/(°)1) CdCO3;2) CdCO3/CaCO3;3) CaCO3

2.4 矿化产物SEM分析

a)×50,000倍矿化产物;b)×200,000矿化产物

2.5 矿化产物IR分析

矿化产物的红外光谱分析(IR)谱图见图5.图5中1639 cm-1处和1034 cm-1处分别为蛋白酰胺I带和II带的CO基振动吸收峰，证明细菌细胞壁通过CO基团吸附了Cd2+、Ca2+.797 cm-1处出现的双峰吸收峰为Si—O—Si的振动，是土壤石英的特征峰；537 cm-1处的吸收峰为Si—O—Al、Si—O—Mg的弯曲振动[13]，显示细菌吸附在了土壤颗粒中的SiO2上.721 cm-1处吸收峰为Cd—O和Ca—O振动叠加，两处为矿化产物的特征峰，1395 cm-1、860 cm-1处吸收峰为CaCO3和CdCO3晶体中C—O基团的弯曲振动，两处吸收峰明显，说明矿化产物中碳酸盐含量较多，与XRD谱图结果一致.

σ/cm-1

2.6 矿化产物EDS分析

分析图4a细菌周围矿化产物的EDS谱图见图6.由图6可见，矿化产物中含有Cd、Ca、Al、Si、Fe、K等金属元素.实验土壤为红棕壤， Ca2+含量较少，Fe3+含量较高；Fe含量为3.32%(以下均为原子百分比)，Ca为0.62%，验证了实验土壤的种类.同时，矿化产物中Ca含量为0.62%，Cd为3.94%，说明Cd含量高于Ca，除了土壤中Cd含量为10 mg/kg外，相比于离子半径为9.9×10-9cm的Ca2+，离子半径为9.7×10-7cm 的Cd2+与细菌的络合强度更大，Cd2+在细菌细胞壁上的有效结合位点更多，因而矿化产物中Cd元素含量较高.

图6 矿化产物的EDS图谱Fig.6 The EDS patterns of mineralized products

Kumari等[14]提出：在产脲酶微生物作用下，镉污染土壤过程中的Cd2+与Ca2+一般以晶格掺杂或单一相CdCO3沉积在单一相CdCO3表面的方式形成共沉淀.为确定CdCO3和CaCO3的结晶方式，使用X射线能谱仪元素分布(EDS-mapping)对矿化产物进行分析，结果见图7.由图7可见，矿化产物中Cd、Ca元素互相掺杂，Cd2+与Ca2+以晶格掺杂的方式形成了共沉淀，由于CdCO3和CaCO3的结晶均以细菌细胞壁上的Cd2+、Ca2+吸附位点展开，但细菌对两种金属阳离子的吸附无选择性，导致Cd2+、Ca2+的结晶位点相邻、相对甚至重叠，形成的CdCO3和CaCO3晶体互相掺杂.

a) 电子图像；b) EDS分层图像；c) Ca Kα1；d) Cd Lα1

3 结论

(1)从湖北省红棕壤中分离出一株高效产脲酶菌株UR-2，生长周期为64 h.该菌株生长过程中分泌的脲酶，对尿素水解率为95.4%，培养液pH达9.15.

(2)投加菌株UR-2可有效提高土壤pH，Cd2+的固化去除率为67.7%，该菌株在镉污染土壤治理中具有一定的潜能.

(3)矿化产物主要为CdCO3和CaCO3，分布在细菌周围，CdCO3和CaCO3为粒径不均匀的椭球形颗粒，细菌细胞壁部分基团络合吸附了Ca2+、Cd2+.

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Isolation of A Urease-producing Bacterium and Its Curing Function of Cd2+in Soil

WangJiyong,YangZilu,ChenJiali,JiangYingjie

(School of Chemistry and Life Science,Wuhan University of Technology, Wuhan 430070)

Microbial induced carbonate mineralization (MICP) is an effective way to repair cadmium polluted soil.A highly efficient urease-producing bacterium was isolated from soil and the curing rate of 10 mg/kg soil Cd2+ion was determined as 67.7%.XRD, EDS, SEM and IR results showed that the sediments were cadmium carbonate and calcium carbonate, which were formed through lattice doping crystallization.

carbonate mineralization bacteria；cadmium carbonate

2016-12-03

王继勇(1966-)，男，副教授，博士，研究方向：土壤重金属污染复，E-mail：wangjiyong66@sina.com

国家自然科学基金资助项目(46120511)

X131.3;S154.3

A

1672-4321(2017)01-0017-04