β-内啡肽过度释放参与脾气虚纳少和腹胀的形成❋

2017-04-13 12:25王凌志柴纪严刘旭东刘文俊赵金茹王守岩单德红张立德王德山
中国中医基础医学杂志 2017年2期
关键词:下丘脑小肠脾气

王凌志,柴纪严,刘旭东,刘文俊,赵金茹,王守岩,单德红,张立德,王德山

β-内啡肽过度释放参与脾气虚纳少和腹胀的形成❋

王凌志,柴纪严,刘旭东,刘文俊,赵金茹,王守岩,单德红,张立德,王德山△

纳少与腹胀是脾气虚证的常见症状,二者常常同时出现,其生物学机制目前尚不清楚。现代医学认为,进食行为主要受控于下丘脑的摄食中枢与饱中枢,二者相互拮抗,前者启动进食行为,后者中断进食。前阿黑皮素(proopiomelanocortin,POMC)神经元为厌食神经元,其合成分泌的 β-内啡肽(βendorphin,β-EP)能够作用于摄食神经元,降低其兴奋性,抑制食欲,中断进食[1-2]。这些中枢信号传至外周后,能够影响肠神经系统分泌β-EP,进而通过抑制胃肠平滑肌兴奋性和Cajal细胞等多条途径降低胃肠动力[3-4]。饮食不节和过度疲劳是诱发脾气虚证的常见病因,而这两个因素也能诱发β-EP过度释放[5-6],因此推测β-EP过度释放在脾气虚纳少与腹胀的发生中起重要作用。为证实此假说,特开展本实验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠20只,体质量(200±10)g,购于辽宁省本溪巿实验动物中心(SCXK(辽)-2010-0001),饲养于辽宁中医药大学实验动物中心(合格证号SYXK(辽)-2013-000-9),室温18~23℃,相对湿度45%~55%,自由饮水进食,适应性饲养1周后开始实验。

1.1.2 试剂 β-EP检测试剂盒和兔抗大鼠β-EPμ受体多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司(中国),羊抗兔IgG、S-P超敏试剂盒和DAB均购于福州迈新生物技术开发有限公司(中国)。

1.1.3 仪器 BIO-RAD iMark酶标仪(美国伯乐公司),BI-2000图像分析系统(中国成都泰盟科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和模型复制及评价 大鼠按随机数字表法分为对照组和脾气虚组(模型组)各10只。对照组不造模,模型组按文献方法[7-8]复制大鼠脾气虚模型并评价,即在15 d内先饱食1 d再禁食2 d,共5个循环,同时每日水温35~37℃游泳至力竭;评价标准:大鼠出现消瘦、食少、神疲乏力、毛色枯槁无光泽等。

1.2.2 大鼠“纳少”评价 主要检测24 h进食/水量,即大鼠单只放入代谢笼24 h后,测量投食/水量和剩余食/水量,二者差值即为其24 h进食/水量。

1.2.3 大鼠“腹胀”评价 采用炭末推进法检测胃残留率和小肠推进率。大鼠禁食不禁水24 h后,给予10%炭粉混悬液(5%活性炭和10%阿拉伯胶)灌胃(1 mL/100 g),30 min后10%水合氯醛麻醉大鼠(0.35 mL/100 g),打开腹腔分别取胃与小肠,量取胃内炭末量与总灌胃量相比为胃残留率;量取小肠内炭粉前端至幽门距离,与幽门至小肠末端距离之比为小肠推进率。

1.2.4 组织β-EP水平检测 取麻醉大鼠的下丘脑、胃和幽门下1~2 cm小肠,制备组织匀浆,冻存备用。采用ELISA方法,严格按试剂盒说明书操作,检测上述组织β-EP水平。

1.2.5 μ受体表达 采用免疫组化法。取麻醉大鼠的全脑、胃和小肠4%多聚甲醛固定后,制备石蜡切片,常规脱蜡至水,双氧水封闭,PBS洗3 min ×3次,柠檬酸缓冲液(0.01 mol/L,pH6.0),微波炉中高火3 min,低火维持15 min,冷却至室温后PBS 洗3 min×3次;滴加血清封闭液,37℃水浴30 min,弃血清,滴加兔抗大鼠μ受体多克隆抗体(1∶300) 4.0℃过夜,37℃水浴2 h;PBS洗3 min×3次,滴加羊抗兔IgG,37℃水浴30 min;PBS洗3 min×3次,DAB显色,苏木素复染,梯度乙醇二甲苯脱水,中性树胶封片。阴性对照采用抗体稀释液代替一抗,步骤同上。μ受体表达呈棕黄色,位于细胞膜上,采用BI-2000图像分析系统分析其平均光密度(MOD)。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行统计分析,数据以均数±标准差(±s)表示,P <0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

实验过程中无动物死亡及脱失情况发生。对照组大鼠体格健壮,饮食正常,反应敏捷,被毛紧密有光泽;模型组大鼠则明显消瘦食少,神疲乏力,反应迟钝,被毛蓬起无光泽,达到模型评价标准。

2.2 大鼠“纳少”和“腹胀”情况

表1显示,与对照组比较,模型组进食量和进水量显著减少(P<0.05,P<0.01),表明该组大鼠出现“纳少”;胃残留率虽有下降但不明显,小肠推进率显著下降(P<0.01),提示该组大鼠存在“腹胀”现象。

2.3 大鼠相关组织β-EP水平和μ受体表达

表2显示,模型组大鼠下丘脑、胃和小肠组织的β-EP水平和μ受体表达均显著高于对照组(P<0.05,P<0.01)。

表1 大鼠“纳少”和“腹胀”评价(±s)

表1 大鼠“纳少”和“腹胀”评价(±s)

注:与对照组比较:*P<0.05,**P<0.01

表2 2组大鼠相关组织β-EP水平及μ受体表达(±s)

表2 2组大鼠相关组织β-EP水平及μ受体表达(±s)

注:与对照组比较:*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

中医认为脾主运化,为气血生化之源,实际上认为脾主导机体的能量摄入,是维持能量稳态的重要因素。从神经生理学的角度来说,能量稳态主要受控于下丘脑的摄食神经元和厌食神经元[9]。POMC神经元为厌食神经元,能够合成释放β-EP抑制摄食神经元,降低食欲,减少食物摄取。肠神经系统受下丘脑影响,除合成释放经典的神经递质外,还能够通过释放β-EP,直接或间接地抑制胃肠电活动,减少乙酰胆碱分泌,增强环形肌张力,减弱纵行肌收缩力,引起胃肠运动停滞[4]。因此,β-EP可以在中枢和胃肠道两个方面影响进食行为。

研究发现,禁食和运动能够诱发β-EP过度释放。自愿坚持5 d以上禁食的患者,其血浆β-EP显著上升[5],体育锻炼或高强度运动也能促进β-EP释放[6-10]。由于禁食和疲劳也是引起脾气虚的常见病因,本实验就采用这两种因素成功复制了大鼠的脾气虚模型,特别是大鼠进食水量明显减少,表明其出现“纳少”的类人症状。此外,本实验还观察到该组大鼠的胃残留率变小,小肠推进率显著下降,提示大鼠还存在“腹胀”现象,即脾气虚大鼠同时出现“纳少”和“腹胀”现象。由于高水平的β-EP能够抑制食欲,减慢胃肠运动,因此推测其参与了脾气虚纳少和腹胀的形成。

首先在下丘脑方面,本实验检测到模型组大鼠下丘脑β-EP水平和μ受体表达均显著升高,提示脾气虚状态下POMC神经元功能亢进,β-EP被大量合成释放,结合其高表达的受体后能够强化对摄食神经元的抑制。研究发现,β-EP能够直接激活K+通道,促进K+外流,使摄食神经元超极化,降低其兴奋性,还可以抑制摄食神经元胞内cAMP合成,削弱其合成释放相关的促食欲成分[11]。由此推测脾气虚时,下丘脑的厌食神经元兴奋,进食神经元抑制,引起食欲下降。其次,本实验观察到,模型组大鼠的胃肠组织中β-EP及μ受体表达水平也显著升高,推测脾气虚时肠神经系统中β-EP能神经元功能增强,大量释放β-EP,与高表达的μ受体结合后可以抑制胃肠电活动,干扰胃肠动力,导致食物推进障碍,出现腹胀。因此本研究认为,β-EP过度释放参与了脾气虚纳少和腹胀的形成。

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(辽宁中医药大学,沈阳 110847)

目的:研究β-内啡肽(β-endorphin,β-EP)与脾气虚纳少和腹胀的关系。方法:20只雄性SD大鼠按随机数字表法分为对照组和脾气虚模型组(模型组),每组10只;代谢笼检测大鼠24 h进食/水量,炭末法评估胃残留率和小肠推进率,ELISA法检测下丘脑、胃和小肠组织β-EP含量,免疫组化法检测下丘脑、胃和小肠组织中μ受体表达。结果:模型组大鼠的进食/水量显著下降,小肠推进率明显下降,下丘脑、胃和小肠组织中β-EP水平和μ受体表达显著增加。结论:β-EP过度释放参与了脾气虚纳少和腹胀的形成。

脾气虚;β-内啡肽;纳少;腹胀;μ受体

Over-relasing of β-endorphin Involves in the Formation of Both the Poor Appetite and Abdominal Distension in Spleen Qi Deficiency

WANG Ling-zhi,CHAI Ji-yan,LIU Xu-dong,LIU Wen-jun,ZHAO Jin-ru,
WANG Shou-yan,SHAN De-hong,ZHANG Li-de,WANG De-shan△
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Shenyang 110847,China)

Objective:To study the relation of β-endorphin(β-EP)in the formation of both the poor appetite and abdominal distension in spleen qi deficiency.Methods:20 male SD rats were randomly divided into the control and spleen qi deficiency group(model group),10 rats each group;metabolic cages were used to detect rat food and water intakes per day;carbon propulsion rate were applied to check the stomach residual rate and small intestine(SI)propelling rate (SIPR);ELISA and immohistochemistry were separately used to measure β-EP concentrations and μ receptor expressions in hypothalamic,stomach and SI tissues.Results:compared with those in the control,model rats significantly showed less food and water intake,reduced SIPR,and enhanced β-EP concentrations and μ receptor expressions of in the hypothalamic,stomach and SI tissues.Conclusion:the overrelease of β-EP involves in the formation of both the poor appetite and abdominal distension in spleen qi deficiency.

Spleen qi deficiency;β-EP;Poor appetite;Abdominal distension;μreceptor

R2-031

B

1006-3250(2017)02-0184-03

2016-07-25

国家重点基础研究发展计划(973计划) (2013CB531702)-“脾主运化、统血”等脾藏象理论研究

王凌志(1977-),男,辽宁沈阳人,副教授,医学硕士,从事中医防治心身疾病的临床与研究。

△通讯作者:王德山(1951-),男,辽宁大连人,教授,医学硕士,从事中医药调控消化吸收的机制研究,Tel:13889217511,E-mail:wwddss5768@163.com。

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