β-内啡肽过度释放参与脾气虚纳少和腹胀的形成❋

王凌志，柴纪严，刘旭东，刘文俊，赵金茹，王守岩，单德红，张立德，王德山

β-内啡肽过度释放参与脾气虚纳少和腹胀的形成❋

王凌志，柴纪严，刘旭东，刘文俊，赵金茹，王守岩，单德红，张立德，王德山△

纳少与腹胀是脾气虚证的常见症状，二者常常同时出现，其生物学机制目前尚不清楚。现代医学认为，进食行为主要受控于下丘脑的摄食中枢与饱中枢，二者相互拮抗，前者启动进食行为，后者中断进食。前阿黑皮素(proopiomelanocortin，POMC)神经元为厌食神经元，其合成分泌的 β－内啡肽(βendorphin，β－EP)能够作用于摄食神经元，降低其兴奋性，抑制食欲，中断进食［1－2］。这些中枢信号传至外周后，能够影响肠神经系统分泌β－EP，进而通过抑制胃肠平滑肌兴奋性和Cajal细胞等多条途径降低胃肠动力［3－4］。饮食不节和过度疲劳是诱发脾气虚证的常见病因，而这两个因素也能诱发β－EP过度释放［5－6］，因此推测β－EP过度释放在脾气虚纳少与腹胀的发生中起重要作用。为证实此假说，特开展本实验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠20只，体质量(200±10)g，购于辽宁省本溪巿实验动物中心(SCXK(辽)－2010－0001)，饲养于辽宁中医药大学实验动物中心(合格证号SYXK(辽)－2013－000－9)，室温18～23℃，相对湿度45%～55%，自由饮水进食，适应性饲养1周后开始实验。

1.1.2 试剂 β－EP检测试剂盒和兔抗大鼠β－EPμ受体多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司(中国)，羊抗兔IgG、S－P超敏试剂盒和DAB均购于福州迈新生物技术开发有限公司(中国)。

1.1.3 仪器 BIO－RAD iMark酶标仪(美国伯乐公司)，BI－2000图像分析系统(中国成都泰盟科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和模型复制及评价 大鼠按随机数字表法分为对照组和脾气虚组(模型组)各10只。对照组不造模，模型组按文献方法［7－8］复制大鼠脾气虚模型并评价，即在15 d内先饱食1 d再禁食2 d，共5个循环，同时每日水温35～37℃游泳至力竭;评价标准:大鼠出现消瘦、食少、神疲乏力、毛色枯槁无光泽等。

1.2.2 大鼠“纳少”评价 主要检测24 h进食/水量，即大鼠单只放入代谢笼24 h后，测量投食/水量和剩余食/水量，二者差值即为其24 h进食/水量。

1.2.3 大鼠“腹胀”评价 采用炭末推进法检测胃残留率和小肠推进率。大鼠禁食不禁水24 h后，给予10%炭粉混悬液(5%活性炭和10%阿拉伯胶)灌胃(1 mL/100 g)，30 min后10%水合氯醛麻醉大鼠(0.35 mL/100 g)，打开腹腔分别取胃与小肠，量取胃内炭末量与总灌胃量相比为胃残留率;量取小肠内炭粉前端至幽门距离，与幽门至小肠末端距离之比为小肠推进率。

1.2.4 组织β－EP水平检测 取麻醉大鼠的下丘脑、胃和幽门下1～2 cm小肠，制备组织匀浆，冻存备用。采用ELISA方法，严格按试剂盒说明书操作，检测上述组织β－EP水平。

1.2.5 μ受体表达 采用免疫组化法。取麻醉大鼠的全脑、胃和小肠4%多聚甲醛固定后，制备石蜡切片，常规脱蜡至水，双氧水封闭，PBS洗3 min ×3次，柠檬酸缓冲液(0.01 mol/L，pH6.0)，微波炉中高火3 min，低火维持15 min，冷却至室温后PBS 洗3 min×3次;滴加血清封闭液，37℃水浴30 min，弃血清，滴加兔抗大鼠μ受体多克隆抗体(1∶300) 4.0℃过夜，37℃水浴2 h;PBS洗3 min×3次，滴加羊抗兔IgG，37℃水浴30 min;PBS洗3 min×3次，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇二甲苯脱水，中性树胶封片。阴性对照采用抗体稀释液代替一抗，步骤同上。μ受体表达呈棕黄色，位于细胞膜上，采用BI－2000图像分析系统分析其平均光密度(MOD)。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

实验过程中无动物死亡及脱失情况发生。对照组大鼠体格健壮，饮食正常，反应敏捷，被毛紧密有光泽;模型组大鼠则明显消瘦食少，神疲乏力，反应迟钝，被毛蓬起无光泽，达到模型评价标准。

2.2 大鼠“纳少”和“腹胀”情况

表1显示，与对照组比较，模型组进食量和进水量显著减少(P＜0.05，P＜0.01)，表明该组大鼠出现“纳少”;胃残留率虽有下降但不明显，小肠推进率显著下降(P＜0.01)，提示该组大鼠存在“腹胀”现象。

2.3 大鼠相关组织β－EP水平和μ受体表达

表2显示，模型组大鼠下丘脑、胃和小肠组织的β－EP水平和μ受体表达均显著高于对照组(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 大鼠“纳少”和“腹胀”评价(±s)

表1 大鼠“纳少”和“腹胀”评价(±s)

注:与对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

表2 2组大鼠相关组织β-EP水平及μ受体表达(±s)

表2 2组大鼠相关组织β-EP水平及μ受体表达(±s)

注:与对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

3 讨论

中医认为脾主运化，为气血生化之源，实际上认为脾主导机体的能量摄入，是维持能量稳态的重要因素。从神经生理学的角度来说，能量稳态主要受控于下丘脑的摄食神经元和厌食神经元［9］。POMC神经元为厌食神经元，能够合成释放β－EP抑制摄食神经元，降低食欲，减少食物摄取。肠神经系统受下丘脑影响，除合成释放经典的神经递质外，还能够通过释放β－EP，直接或间接地抑制胃肠电活动，减少乙酰胆碱分泌，增强环形肌张力，减弱纵行肌收缩力，引起胃肠运动停滞［4］。因此，β－EP可以在中枢和胃肠道两个方面影响进食行为。

研究发现，禁食和运动能够诱发β－EP过度释放。自愿坚持5 d以上禁食的患者，其血浆β－EP显著上升［5］，体育锻炼或高强度运动也能促进β－EP释放［6－10］。由于禁食和疲劳也是引起脾气虚的常见病因，本实验就采用这两种因素成功复制了大鼠的脾气虚模型，特别是大鼠进食水量明显减少，表明其出现“纳少”的类人症状。此外，本实验还观察到该组大鼠的胃残留率变小，小肠推进率显著下降，提示大鼠还存在“腹胀”现象，即脾气虚大鼠同时出现“纳少”和“腹胀”现象。由于高水平的β－EP能够抑制食欲，减慢胃肠运动，因此推测其参与了脾气虚纳少和腹胀的形成。

首先在下丘脑方面，本实验检测到模型组大鼠下丘脑β－EP水平和μ受体表达均显著升高，提示脾气虚状态下POMC神经元功能亢进，β－EP被大量合成释放，结合其高表达的受体后能够强化对摄食神经元的抑制。研究发现，β－EP能够直接激活K+通道，促进K+外流，使摄食神经元超极化，降低其兴奋性，还可以抑制摄食神经元胞内cAMP合成，削弱其合成释放相关的促食欲成分［11］。由此推测脾气虚时，下丘脑的厌食神经元兴奋，进食神经元抑制，引起食欲下降。其次，本实验观察到，模型组大鼠的胃肠组织中β－EP及μ受体表达水平也显著升高，推测脾气虚时肠神经系统中β－EP能神经元功能增强，大量释放β－EP，与高表达的μ受体结合后可以抑制胃肠电活动，干扰胃肠动力，导致食物推进障碍，出现腹胀。因此本研究认为，β－EP过度释放参与了脾气虚纳少和腹胀的形成。

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(辽宁中医药大学，沈阳 110847)

目的:研究β－内啡肽(β－endorphin，β－EP)与脾气虚纳少和腹胀的关系。方法:20只雄性SD大鼠按随机数字表法分为对照组和脾气虚模型组(模型组)，每组10只;代谢笼检测大鼠24 h进食/水量，炭末法评估胃残留率和小肠推进率，ELISA法检测下丘脑、胃和小肠组织β－EP含量，免疫组化法检测下丘脑、胃和小肠组织中μ受体表达。结果:模型组大鼠的进食/水量显著下降，小肠推进率明显下降，下丘脑、胃和小肠组织中β－EP水平和μ受体表达显著增加。结论:β－EP过度释放参与了脾气虚纳少和腹胀的形成。

脾气虚;β－内啡肽;纳少;腹胀;μ受体

Over-relasing of β-endorphin Involves in the Formation of Both the Poor Appetite and Abdominal Distension in Spleen Qi Deficiency

WANG Ling－zhi，CHAI Ji－yan，LIU Xu－dong，LIU Wen－jun，ZHAO Jin－ru，
WANG Shou－yan，SHAN De－hong，ZHANG Li－de，WANG De－shan△
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning Shenyang 110847，China)

Objective:To study the relation of β－endorphin(β－EP)in the formation of both the poor appetite and abdominal distension in spleen qi deficiency.Methods:20 male SD rats were randomly divided into the control and spleen qi deficiency group(model group)，10 rats each group;metabolic cages were used to detect rat food and water intakes per day;carbon propulsion rate were applied to check the stomach residual rate and small intestine(SI)propelling rate (SIPR);ELISA and immohistochemistry were separately used to measure β－EP concentrations and μ receptor expressions in hypothalamic，stomach and SI tissues.Results:compared with those in the control，model rats significantly showed less food and water intake，reduced SIPR，and enhanced β－EP concentrations and μ receptor expressions of in the hypothalamic，stomach and SI tissues.Conclusion:the overrelease of β－EP involves in the formation of both the poor appetite and abdominal distension in spleen qi deficiency.

Spleen qi deficiency;β－EP;Poor appetite;Abdominal distension;μreceptor

R2－031

B

1006－3250(2017)02－0184－03

2016－07－25

国家重点基础研究发展计划(973计划) (2013CB531702)－“脾主运化、统血”等脾藏象理论研究

王凌志(1977－)，男，辽宁沈阳人，副教授，医学硕士，从事中医防治心身疾病的临床与研究。

△通讯作者:王德山(1951－)，男，辽宁大连人，教授，医学硕士，从事中医药调控消化吸收的机制研究，Tel:13889217511，E－mail:wwddss5768@163.com。