异位生发中心在干燥综合征靶器官损害中的作用

王　婧，张　文，陈丽萌

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院肾内科, 北京 100730)

ChinJAllergyClinImmunol，2017，11(2)：166- 173

原发干燥综合征是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，我国人群的患病率为0.3%～0.7%[1]。其病理基础是自身免疫性上皮炎[2]。干燥综合征的常见临床症状是唾液腺及泪腺受累所致的口眼干燥，伴随疼痛、乏力等，20%～40%的患者会出现多系统器官受累，包括淋巴结肿大、皮肤血管炎、关节炎、肌炎以及肺部、肝脏、肾脏和神经等系统损伤，严重者可发展为淋巴瘤[3]。但其发病机制并不清楚，推测是在遗传因素背景下，多种环境因素，特别是病毒感染等诱因的共同作用结果，体液免疫和细胞免疫同时参与其中。生发中心位于外周淋巴样组织(如脾脏、淋巴结等)中，B细胞在此增殖、分化、经历选择过程而产生抗原特异性高亲和力抗体，如果出现在经典淋巴组织之外，则称为异位生发中心[4]，是多种自身免疫性疾病中重要的免疫激活场所。本研究将简述异位生发中心形成及炎症反应在干燥综合征靶器官损伤中的作用。

异位生发中心炎症反应机制

脾脏和淋巴小结等次级淋巴样器官的生发中心内，存在活化诱导胞嘧啶脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase, AID)和滤泡树突细胞网状结构[5]，B细胞在其中接受抗原刺激和T细胞的辅助活化，发生体细胞高频突变(somatic hypermutation, SHM)和免疫球蛋白基因类别转换重组(class switch recombination, CSR)等过程，经历阳性及阴性选择，具备产生高亲和力抗体的能力[6]。生发中心由位于中心的B细胞聚集区(暗区)和位于外周的T细胞聚集区(明区)组成(模式图见图1)。自身免疫性疾病的受累靶器官中也有这种结构，因位于经典淋巴器官之外而称为异位生发中心[4]，可以发生类似的反应使得体液免疫持续活化，始动因素是树突细胞募集进行抗原呈递，而其关键环节是B细胞在多种炎症因子和趋化信号下定向迁移、活化。

图1　生发中心模式图[4]Fig 1　Germinal center pattern[4]T cell:T细胞； fDC:滤泡树突细胞； B cell:B细胞

树突细胞呈递抗原，启动生发中心炎症反应

异位生发中心的标志之一是抗原长期存在，持续激活局部免疫反应。作为体内已知功能最强的专职抗原呈递细胞，树突状细胞(dendritic cell, DC)是启动、调控和维持免疫应答的中心环节[7]。滤泡树突细胞(follicular dendritic cell, fDC)分布于淋巴滤泡区，是异位生发中心的标记之一。人类树突细胞均起源于造血前体细胞，下游分为淋巴样前体细胞和髓样前体细胞，前者分化为浆细胞样树突细胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)，主要存在于血液和淋巴样组织中，经血液循环进入淋巴小结；后者分化为髓系树突细胞(myeloid dendritic cell, mDC)，主要存在于淋巴样和非淋巴样组织中[8]。三者分工合作，共同完成抗原呈递过程，启动异位生发中心炎症反应。

fDC维持异位生发中心反应:fDC是一类非造血来源的特殊树突样细胞，它源自表达PDGFRβ的血管旁细胞[9]，主要位于淋巴滤泡B细胞区。fDC在生发中心反应中的关键性作用主要体现在长期保有抗原和募集淋巴细胞两方面。首先，fDC高表达补体受体CR1 (CD35)和CR2 (CD21)，能够长期保有并持续呈递抗原。无论是将补体C3还是将CR2基因敲除，小鼠体内的fDC均会丧失长期保有抗原的功能，生发中心反应难以维持[10]。此外，fDC还表达多种生发中心微环境形成所必需的趋化因子或黏附分子，例如CXCL13，它可以与Tfh细胞和滤泡B细胞表面的CXCR5相互作用，促进这些免疫细胞归巢[11]，这一作用在类风湿关节炎小鼠模型中已被证实[12]。又如在核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号作用下fDC高表达整合素受体细胞间黏附分子- 1(intercellular adhesion molecular- 1，ICAM- 1)和血管内皮细胞黏附分子- 1(vascular cell adhesion molecular- 1，VCAM- 1)，在NF-κB信号通路受抑制的小鼠模型中使得ICAM- 1/VCAM- 1表达降低，发现fDC仍然能够保有抗原，但形成的生发中心结构较小，B细胞凋亡增加，IgG免疫活性也降低[13]。

pDC募集并参与局部抗原呈递:pDC的免疫表型是CD4+CD45RA+IL- 3Rα(CD123)+ILT1-CD11c-Lineage-。新近研究提示，pDC除参与固有免疫途径外，在接受病毒感染等刺激后还会发生形态和表型转化，高表达主要组织相容性复合体(major histocompa-tibility complex，MHC) Ⅰ和MHCⅡ分子，呈递内源性抗原[14- 15]；并表达多种C型凝集素或唾液酸结合免疫球蛋白样受体[16]，具备和经典树突细胞相类似的捕获、加工并呈递外源性抗原的能力。pDC的另一特点是迁移能力。在接受活化信号之后可直接从外周循环经高内皮小静脉迁移进入发生炎症反应的局部淋巴小结[17]。自身免疫性疾病的受累靶器官往往是pDC趋化募集的场所。在干燥综合征患者中，流式细胞学[18]和质谱流式细胞技术[19]都证实疾病早期外周血pDC比例下降，同时涎腺组织中可见BECA2+pDC浸润[20]，但异位生发中心反应中pDC介导的靶器官损伤的具体作用并不清楚。

mDC直接诱导异位生发中心反应启动：mDC作为经典的树突细胞，具有很强的加工和呈递抗原的能力[21]。外周血中的mDC处于未成熟状态，起前哨细胞的作用，当受到抗原刺激时可以迅速分化成熟并迁移到炎症组织，通过多种模式识别受体蛋白捕获抗原并有效激活T细胞[22]。mDC在外周组织微环境的诱导下可进一步分化为单核细胞来源树突细胞(monocyte-derived dendritic cell，mo-DC)[8]，直接参与炎症反应诱导生发中心形成的过程。Ludewig等建立胰岛β细胞表达淋巴细胞性脑膜炎糖蛋白的转基因小鼠模型，发现反复用表达相同病毒蛋白表位的树突细胞免疫后，胰岛间质生发中心反应启动，胰岛β细胞破坏，小鼠可发生自身免疫性糖尿病[4]。另一项研究则发现，小鼠在被流感病毒感染后，肺脏出现异位生发中心(即黏膜相关淋巴组织)，此时若清除体内CD11c+mDC，该结构不能维持；将肺脏组织中的CD11b+mDC从体内分离，虽然其抗原呈递能力消失，但仍能产生各种淋巴毒素和趋化因子，诱导异位生发中心的产生[23]。但目前还缺乏mDC与干燥综合征异位生发中心形成的关系的研究。

B细胞在生发中心内完成增殖及筛选，分化成熟

生发中心是B细胞分化成熟的场所[24]。B细胞在生发中心的增殖分化是一个动态过程。受到抗原刺激的生发中心前体B细胞首先进入“暗区”，作为生发中心母细胞，在增殖同时发生体细胞高频突变，B细胞受体(B cell receptor,BCR) V(D)J区基因重排，而后迁移至“明区”接受阳性选择，筛选出较高亲和力B细胞即生发中心B细胞，再次回到“暗区”进一步增殖并发生体细胞突变，这一“增殖分化-筛选”的过程循环往复，最终筛选出与抗原亲和力很高的BCR，分化成为记忆B细胞或浆细胞[25]。在这个过程中，滤泡T辅助细胞(follicular T helper cell, Tfh)和细胞因子白细胞介素(Interleukin，IL)- 21起到了关键性作用。

Tfh细胞参与生发中心B细胞选择：Tfh特征性表达CXCR5，程序性死亡受体1(programmed death 1，PD- 1)，SAP(SLAM-associated protein)和ICOS(inducible costimulator)等表面分子，并且大量分泌IL- 21[26]。其主要特点包括定向迁移和参与B细胞阳性选择。定向迁移是指具备CXCR5highCCR7low表型的Tfh细胞在趋化因子配体CXCL13的引导下定向移动到淋巴滤泡明区和暗区的交界处，得以与受到抗原刺激的B细胞接触并提供辅助信号[27]，这与生发中心反应强度相关，研究显示敲除CXCR5后生发中心反应强度下降2倍[28]。不同于传统抗原竞争学说，新近的T细胞信号竞争学说认为，所有接受阳性选择的B细胞都可以按照其BCR的亲和力高低成比例地结合抗原，获得足以保证其存活的抗原信号强度；但只有亲和力高的B细胞可以获取到更多抗原，从而将加工后的抗原多肽通过MHCⅡ呈递给T细胞，竞争到足够的T细胞信号而存活下来。因此，抗原传递的只是生存信号，提供B细胞存活的必要条件；T细胞传递的才是选择信号，是决定B细胞存活或凋亡的限制性步骤[29- 30]。 而Tfh细胞能够高表达PD- 1、ICOS等共刺激分子，正是B细胞完成生发中心反应必需的选择信号。

IL- 21直接活化生发中心B细胞：IL- 21是具有多种免疫效应的炎症因子，可由多个亚群的活化T细胞产生[31]。 IL- 21/IL- 21R通路通过JAK-STAT胞内信号途径激活下游基因的转录，与自身免疫反应密切相关[32]。在异位生发中心内IL- 21同时参与T细胞区和B细胞区免疫反应的维持放大。首先，IL- 21可以正反馈调节Tfh细胞。它通过自分泌方式激活CD4+T细胞内Bcl- 6的转录，促进其表达CXCR5、PD- 1及ICOS，分化成为Tfh细胞[33- 34]。在BXD2-IL21(-/-)小鼠体内转入AdIL- 21，可以观察到脾脏内Tfh和生发中心B细胞比例升高，同时具有免疫抑制效应的调节性滤泡T细胞(follicular regulatory T cells，Tfr)的表型也向Tfh转变，促进自身抗体产生[35]。其次，IL- 21能够直接作用于B细胞，IL- 21R在生发中心B细胞和活化的记忆B细胞中表达水平均显著上调是直接的证据[36]。体外实验中，IL- 21能够刺激受到CD40-CD40L信号活化的纯真B细胞产生IgG1/IgG3抗体[37]；IL- 21和BCR信号的共同刺激还可以使得B细胞中B细胞成熟蛋白 1(Blymphocyte maturation protein1，BLIMP1)和活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase，AID)的转录被激活，诱导其分化为浆细胞[38- 39]。IL- 21转基因小鼠会出现高γ球蛋白血症，B细胞类别转换频率增加，浆细胞比例升高；而IL- 21R缺乏的小鼠在受到病毒感染后体液免疫水平降低，BCR亲和力成熟，分化为记忆B细胞或浆细胞的过程均被抑制[40]。特异性敲除B细胞表面IL- 21R的实验进一步证实，生发中心结构的形成直接决定于B细胞IL- 21/IL- 21R信号[41]。

IL- 17介导生发中心炎症反应，产生效应

IL- 17主要由Th17细胞产生，可在病理条件下介导炎症反应放大和组织损伤， IL- 17A是其家族主要成员[42]。很多证据都提示Th17/IL- 17和异位生发中心炎症反应的关系密切。首先，Th17细胞与异位生发中心形成早期必需的淋巴组织诱导(Lymphoid tissue inducer, LTi)细胞有共同的发育起源和表面标记。有证据表明，Th17在分化过程中会表达LTi细胞特征性的核受体RORγt，将RORγt基因敲除后，小鼠将缺乏淋巴小结及Peyer斑等次级淋巴样组织结构[42]。二者还具有相同的表面分子LTα1β2、CCR6、TLR和IL- 17R等，并且都能够在IL- 23刺激下分泌IL- 17。其次，在动物模型中Th17/IL- 17能够直接促进异位生发中心结构的形成。Randoll等发现即便在LTi细胞存在的情况下，IL- 17A基因敲除的小鼠仍然不能受LPS刺激而在支气管黏膜组织中产生具有免疫应答功能的异位生发中心，并推测这一过程依赖于IL- 17A诱导CXCL13、CCL21等趋化因子的表达[43- 44]。Kuchroo等证明在诱导产生自身免疫性脑炎的小鼠模型中，Th17细胞通过分泌IL- 17并特异性表达Podoplanin蛋白促进中枢性经系统血管周异位生发中心的形成[45]。Stockinger等在IL- 17基因荧光素报告小鼠模型中观察到Th17细胞会选择性归巢至小肠Peyer斑，分化为Tfh细胞表型而直接活化B细胞产生抗体[46]，说明IL- 17不仅促进生发中心形成，还参与其免疫效应。第三，Th17/IL- 17与自身免疫性疾病组织损伤密切相关。在类风湿关节炎滑膜组织中，异位生发中心相关的IL- 17可以直接作用于成纤维细胞和巨噬细胞，诱导TNF- α、IL- 1β、IL- 6等多种炎症因子表达上调，募集中性粒细胞并介导滑膜及软骨损伤[47- 48]。在涎腺形成生发中心时，局部IL- 17蛋白和mRNA水平均更高[49- 50]，并且和病理损伤程度正相关[50]，这说明IL- 17通路在涎腺病变中能同时介导异位生发中心反应和上皮细胞损伤。我们在前期研究中发现，干燥综合征合并膜性肾病患者的肾脏组织IL- 17A与共刺激分子B7- 1的表达呈显著正相关，提示肾脏局部抗原可能呈递给Th17细胞而参与球-管损伤。但IL- 17A在干燥肾损害中的直接作用同样还有待进一步探索。

干燥综合征涎腺异位生发中心形成与靶器官损害

异位生发中心是机体通过不断加强局部免疫反应，对各种应激刺激产生适应的一种机制，在不同情况下作用各异。当机体遭遇细菌或病毒感染时，感染灶局部形成的异位生发中心可以有效地局限并清除病原体，起到保护性作用[51- 52]；而在自身免疫性疾病和移植排异反应中，针对自身抗原不断增强的免疫反应则会导致组织病理损伤。

目前已经在多种自身免疫性疾病中发现有异位生发中心结构存在，包括类风湿关节炎的滑膜组织[53]、系统性红斑狼疮的肾脏间质[54]、多发性硬化的脑膜组织[55]、干燥综合征的涎腺组织[4]、桥本甲状腺炎的甲状腺组织[56]以及自身免疫性糖尿病小鼠的胰岛间质组织[57]等。有证据表明，这些具有生发中心结构和功能的淋巴样组织并非是炎症刺激下发生的非特异性反应，而可以针对局部抗原产生组织特异性抗体，引起各靶器官损伤。

在肾脏，Clark等用显微切割技术获取系统性红斑狼疮合并间质性肾炎患者肾脏异位生发中心的CD38+Ki67+B细胞，制备细胞内克隆增殖免疫球蛋白的可变区单抗，利用质谱和蛋白质组方法，发现其共同自身抗原是波形蛋白，同时免疫组化结果显示这类患者的肾间质波形蛋白高表达，外周血抗波形蛋白抗体 (anti-vimentin antibodies,AVA)滴度与肾间质损害程度正相关，从而证实了异位生发中心可以产生针对局部组织特异的致病性自身抗体[58]。在关节滑膜，Humby等建立了类风湿关节炎和重症联合免疫缺陷嵌合体小鼠模型，这种小鼠缺少次级淋巴组织，但其滑膜组织的异位生发中心结构内仍然可以发生持续活跃的体细胞高频突变和免疫球蛋白类别转换，产生抗瓜氨酸合成蛋白抗体 (Anti citrullinated protein/peptide antibodies，ACPA)[59]，导致滑膜病理损伤。

在涎腺，还缺少动物模型为异位生发中心与组织损伤提供直接证据，但一些研究线索具有提示意义。首先，涎腺淋巴组织在结构和功能上同时具备生发中心的特点。早在1998年，即有学者通过对干燥患者涎腺淋巴浸润灶中B细胞IgV基因的克隆和测序，证明这些B细胞在局部抗原驱动下，发生了IgV基因重排和免疫球类型转换，而并非由临近的淋巴组织迁移而来[60]；此后，进一步发现该微环境内AID高表达，B细胞能够完成分化增殖过程，产生特异性抗体[61]。其次，病毒感染是干燥综合征发病的诱因之一[62]，可能通过异位生发中心起作用。Bombardieri等用复制功能缺陷的腺病毒(adenovirus，AdV)特异性感染野生型C57BL/6小鼠的涎腺，发现这些小鼠的涎腺有功能完善的异位生发中心结构形成，局部产生抗AdV抗体和抗核抗体，并且出现唾液流率降低等表现[63]。更有力的证据来自EB病毒相关研究，在干燥患者涎腺生发中心内不仅能检测到潜伏的EB病毒感染，在部分浆细胞中还观察到其裂解活化的过程[64]，而这些浆细胞对干燥综合征相关抗原Ro52具有特异的反应性。将有EB病毒阳性异位生发中心的涎腺移植到严重联合免疫缺陷小鼠体内构建嵌合体，发现仍持续有抗Ro/La抗体产生[65]。第三，多项研究结果提示涎腺异位生发中心形成也具有临床意义。据文献报道其在小涎腺活检中阳性率为18.3%～33.3%，平均为(25.1±5.0)%。荟萃分析结果显示，生发中心阳性与腺体病理损伤中，唾液流率低，抗Ro/SSA和抗La/SSB水平升高相关[66]，还是腺体外多器官系统受累重的独立相关因素[67]。此外，伴有生发中心形成的患者血清中具有免疫激活效应多种炎症因子，如IL- 1β、IL- 1RA、IL- 4、IL12p40、IL17、α干扰素(Interferon-alpha，IFN-α)、γ干扰素(Interferon-gamma，IFN-γ)、B细胞活化因子受体 (B-Cell Activation Factor Receptor，BAFF)等和CCL- 2、CCL- 11等趋化因子表达水平都有显著升高[68- 69]。一项纳入175例患者的回顾性队列研究发现，随访期间发生非霍奇金淋巴瘤患者起病初期涎腺生发中心的阳性率明显偏高[70]；近期荟萃分析结果也提示生发中心形成对远期出现淋巴瘤有较高的预测值[71]。最近一项随机双盲、安慰剂对照临床实验观察到，使用CD20单抗(利妥昔单抗)治疗12周后重复行腮腺活检，生发中心个数明显减少，直接说明B细胞与生发中心形成的因果关系，且可能是靶向治疗关键位点。

总结与展望

干燥综合征是以自身免疫性上皮炎为病理基础的疾病，异位生发中在多种自身免疫性疾病靶器官受累中的作用已经被证实，而在干燥肾损伤中的作用并不清楚，干燥综合征时靶器官局部的抗原呈递，B细胞募集活化，原位自身抗体的产生等可能是关键的切入点，现阶段仍需要进一步评价异位生发中心与干燥综合征靶器官损害临床病理及预后的关系，探索其中起到关键性作用的分子或炎症介质，为靶向治疗提供潜在的干预位点。

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