鸡蛋组分蛋白对临床诊断儿童鸡蛋过敏的价值

张书辰，祝戎飞，杨　林，张　威，李文静，黄　南，项　宁，汪　茵，胡林涛，王晓龙

(华中科技大学同济医学院附属同济医院过敏反应科,武汉430030)

ChinJAllergyClinImmunol，2017，11(2)：149- 155

鸡蛋过敏是婴幼儿和儿童最常见的一种食物过敏现象[1]。鸡蛋过敏在临床上有多重表现，可累及口腔(黏膜)、皮肤、呼吸系统、消化系统、血管。严重速发型反应可引起过敏性休克，导致患者死亡。而因过敏导致的迟发型症状影响儿童营养吸收，导致患儿生长发育迟缓[2]。我国对720例特异性的儿童食物过敏发生率的调查研究发现, 鸡蛋过敏皮肤点刺试验(skin prick test，SPT)阳性69例(9.58%), 最后确诊42例(5.83%), 占食物过敏第1位[3]。在临床观察中，2/3的鸡蛋过敏症儿童在5～6岁症状可减轻或消失, 但1/3的患儿可持续出现过敏症状。鸡蛋过敏儿童经过一段时期的无鸡蛋饮食后再予口服激发, 发现部分儿童可耐受, 另一部分儿童仍持续过敏[4]。鸡蛋蛋白丰富，而主要致敏蛋白在蛋清中，目前发现23种糖蛋白，但能与人血清免疫球蛋白(immunoglobulin E，IgE)结合并引起过敏反应的主要有4种[5- 9]，分别是卵白蛋白(相对分子质量45 000，约占蛋清总蛋白54%)[10]、卵类黏蛋白(相对分子质量28 000，约占蛋清总蛋白11%)[11]、卵转铁蛋白(相对分子质量为80 000，约占蛋清总蛋白12%)[12]和溶菌酶(相对分子质量14 000，约占蛋清总蛋白3.4%)[13]。目前检验的“金标准”UniCap检测血液中特异性IgE不能有效区分过敏儿童是否能进展为鸡蛋耐受。本试验通过检测组分蛋白和鸡蛋过敏患者血清中特异性IgE结合情况，分析各蛋白组分对鸡蛋过敏的临床诊断价值。

材料与方法

构建质粒

查询天然四种鸡蛋清蛋白设计Gal d 1～4四种鸡蛋清蛋白的碱基序列，交由上海Invitrogen公司进行化学合成，将合成好的序列克隆入pEGFP-N1载体，并测序验证重组克隆插入片段的序列信息，保留含有正确目的序列的质粒。

构建稳转细胞系

质粒转染：将Cos- 7细胞转染阴性对照质粒，发现lipofectamine 2000和质粒DNA的比例为2.5∶1时细胞的转染效果最佳，带目的基因的质粒均选用此浓度进行转染。

靶细胞抗生素剂量筛选：构建的质粒带有G418(Geneticin,遗传霉素)抗性，根据抗生素的剂量范围和Cos- 7细胞的筛选信息，将细胞培养基中G418设定100、200、300、400、500、600 mg/L共6个浓度梯度，根据细胞培养至第3天和第7天时细胞存活数量，将Cos- 7细胞G418的筛选剂量定为400 mg/L。

质粒转染Cos- 7细胞及混合克隆Cos- 7细胞稳定系筛选：将含有目的基因的质粒瞬时转染Cos- 7细胞，转染24 h后消化细胞并传代，待细胞贴壁后加入前期筛选出的抗生素剂量G418 400 mg/L。持续观察细胞的筛选情况，每3天换1次含有抗生素的完全培养基，持续筛选2～3周。扩增并冻存细胞，并对细胞进行基因和蛋白水平的检测。

目的蛋白的扩增、纯化及鉴定

复苏并扩增含有目的基因的Cos- 7细胞，待细胞长满后，收集细胞的蛋白样品。采用 Ni2+柱亲和层析的方法纯化各重组蛋白，将纯化后的蛋白定量后用Western blot方法验证目的蛋白，四种蛋白抗体均来源于AbboMax公司(美国)。

患儿血清及资料的收集

本实验所用血清均来源于有鸡蛋过敏史的患儿，且经CAP变应原检测法测定鸡蛋特异性IgE>0.35 kU/L。收集的血清冻存于-80 ℃冰箱备ELISA检测用。资料的收集包括患儿性别、年龄、鸡蛋特异性IgE数值(UniCap)、过敏原SPT(北京协和新华联)结果。

ELISA法测定鸡蛋过敏患者血清中卵白蛋白、卵类黏蛋白、转铁蛋白和溶菌酶的蛋白含量

将各目的蛋白按5、10、20和50 mg/L的浓度梯度包被96孔板，待检测血清用1∶1稀释，根据在450 nm处测得光密度值(optical density，OD)450 nm，发现卵白蛋白和卵类黏蛋白在10 mg/L时包被量达到饱和，转铁蛋白和溶菌酶蛋白在20 mg/L时包被量达到饱和。目的蛋白根据各自不同的最佳包被浓度在4 ℃包被过夜，第2天加入待测血清(1∶1稀释)孵育90 min，之后加入生物素化抗体工作液孵育60 min，再加入酶结合物稀释液孵育30 min，以上每个步骤结束之后用TBST洗5次，孵育温度为37 ℃。最后加入显色液并适时终止，用酶标仪测量OD450 nm。

统计学处理

结　　果

目的基因表达检测和重组蛋白鉴定

提取各稳转细胞样品总RNA，通过realtime-PCR法检测各细胞样品中目的基因和内参基因的表达量。发现根据四种天然鸡蛋清蛋白设计的引物，目的基因得到有效扩增。随后，将用稳转细胞系培养获得卵白蛋白、卵类黏蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶四种蛋白纯化，并将纯化后的蛋白进行Western blot检测其表达情况。由于每个目的蛋白均融合了相对分子质量约28 000的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，所以检测到的目的蛋白相对分子质量均偏大。用特异性抗体检测到的重组卵白蛋白相对分子质量约73 000，重组卵转铁蛋白相对分子质量约108 000，重组卵类黏蛋白相对分子质量约56 000，重组溶菌酶相对分子质量约42 000，构建的稳转细胞系能产生特异性的卵白蛋白、卵类黏蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶(图1)。

纳入受试者的基本资料

共纳入60例鸡蛋过敏的患儿，平均年龄为4.3(0.8～7.5)岁。根据患儿血清蛋白ELSA检测结果，发现鸡蛋特异性IgE含量>10 kU/L的患儿在四种鸡蛋蛋白抗体中主要以卵白蛋白抗体为主，而鸡蛋特异性IgE含量<10 kU/L的患儿以卵类黏蛋白抗体为主。因此，根据鸡蛋特异性IgE含量将患儿分为两组，鸡蛋特异性IgE>10 kU/L组(22例)和鸡蛋特异性IgE <10 kU/L组(38例)，两组在年龄和性别比上差异均无统计学意义。鸡蛋特异性IgE >10 kU/L组的患儿鸡蛋过敏原点刺阳性率明显高于鸡蛋特异性IgE <10 kU/L组(表1)。

图1重组蛋白表达

A:Western blot验证纯化后的重组卵转铁蛋白和重组卵白蛋白的表达; B:验证纯化后的重组卵类黏蛋白和重组溶菌酶的表达

Fig1Expression of recombinant protein

A:Expression validated by Western blot of recombinant egg transferrin and recombinant ovalbumin after purification; B:Expression validated by Western-Blot of recombinant egg leptin and recombinant lysozyme after purification

Mr:相对分子质量

表1　纳入受试者的基本资料Table 1　Basic information of patients

血清蛋白检测结果

对60例鸡蛋过敏患儿血清中的卵白蛋白、卵类黏蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶四种抗体进行ELISA检测，发现4种重组蛋白均能与特异性IgE发生反应，重组蛋白具有免疫活性。四种蛋白所测 OD450 nm的平均值分别为卵白蛋白0.567、卵类黏蛋白0.81、卵转铁蛋白0.154和溶菌酶0.096(图2)，在鸡蛋过敏中，卵类黏蛋白和卵白蛋白为过敏原的主要成分。

卵白蛋白和卵类黏蛋白与血清鸡蛋特异性IgE的关系

在检测的60例鸡蛋过敏血清中，25例(41.6%)患儿血清中以卵白蛋白抗体为主，34例(56.6%)患儿血清中以卵类黏蛋白抗体为主，1例以转铁蛋白抗体为主。将4种鸡蛋组分蛋白OD450 nm的数值与鸡蛋特异性IgE含量进行相关性分析，发现血清卵白蛋白抗体含量与鸡蛋特异性IgE的值呈显著正相关关系(p=0.808 4,P<0.000 1)，而这种相关性在其余三种组分蛋白中不明显(图3)。随后又将鸡蛋特异性IgE含量与卵白蛋白和卵类黏蛋白OD450 nm的数值进行相关性分析，发现血清鸡蛋特异性IgE>10 kU/L的患儿，其血清IgE的值与血清卵白蛋白抗体含量(OD450 nm的数值)呈明显正相关关系(p=0.630 9,P=0.002 2), 鸡蛋特异性IgE<10 kU/L的患儿，其血清IgE的值与血清卵类黏蛋白抗体含量呈明显正相关关系(p=0.756 0,P<0.000 1)(图4)。

讨　　论

目前由于鸡蛋过敏的患者并无特殊的诊疗方案，传统临床采用的天然变应原粗提取液由于纯度不够，杂质较多，往往会导致假阳性结果，而粗提取液中的杂质不明，亦可导致患者出现局部和全身的不良反应，严重时会导致休克甚至死亡[14]。而今，在实验室中尝试开发提取高纯的重组过敏原对过敏原的标准化进程有着十分重要的价值，并为控制脱敏治疗中的风险有非常重要的意义[15]。现试验结果表明，通过质粒转染技术可人工合成的重组蛋白完全可由实验室人工备制[16]，而其蛋白活性均可达到临床检验标准。

SPT在过敏原的粗筛过程中有一定价值，它减小了过敏原体内检测引起不良症状的风险[17]。但是由于皮肤组织的结构特点，其特异度和敏感度不高，往往在临床运用中引起结果判读的偏差。通过测得患者血清特异性IgE和点刺结果相对比，鸡蛋特异性IgE>10 kU/L组的患儿鸡蛋过敏原点刺阳性率明显高于<10 kU/L组(P=0.000 3)，发现高血清IgE患者在SPT中，更容易出现阳性结果，而低IgE的鸡蛋蛋白对SPT的敏感性较低，这导致临床检查中，往往可能因为鸡蛋点刺结果为阴性而被临床医师忽视。由此可见，对于鸡蛋过敏原的检测，SPT和血清学特异性IgE检测都是必不可少的[18]。

图3血清卵白蛋白、卵类黏蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶抗体含量(用OD450 nm表示)与鸡蛋特异性IgE的相关性

Fig3Correlations between egg-specific IgE and ovalbumin, ovo mucin, egg transferrin, lysozyme in serum (expressed in D450 nm)

图4血清卵白蛋白抗体含量与鸡蛋特异性IgE<10 kU/L(A)和>10 kU/L(B)时的相关性；血清卵类黏蛋白抗体含量与鸡蛋特异性IgE<10 kU/L(C)和>10 kU/L(D)的相关性

Fig4Correlation between ovalbumin antibody and egg specific IgE<10 kU/L(A) and egg specific IgE>10 kU/L(B); Correlation between ovo mucin antibody and egg specific IgE<10 kU/L(C) and egg specific IgE>10 kU/L(D)

现公认的蛋清中过敏原主要有四类，卵类黏蛋白、卵白蛋白、卵转铁蛋白和溶菌酶。而通过此实验表明，在本科室受测人群中，以卵类黏蛋白和卵白蛋白居多，分别占56.6%和41.6%，笔者认为这两个组分蛋白为4个蛋清组分蛋白中的主要致敏原。而把结果进一步分组发现，鸡蛋特异性IgE含量高(>10 kU/L)的患儿血清中卵白蛋白抗体含量较高，而特异性IgE<10 kU/L的患儿血清中卵类黏蛋白抗体含量高。结合上述点刺结果分析(鸡蛋特异性IgE>10 kU/L较易显现皮肤点刺阳性结果)，点刺中阳性结果的发生可能主要为卵白蛋白引起。但由于涉及安全及伦理问题，目前尚无法使用卵白蛋白或其他组分蛋白直接对患者行皮肤试验，无法对各类组分蛋白在点刺液中的组成比例而影响皮肤的刺激性造成假阳性结果进行评估[19]。所以，也无法评价各类组分蛋白的含量在皮肤试验中的具体作用。因此，对于鸡蛋过敏以及各类食物过敏，目前仍需按照国际指南标准，以食物激发试验作为食物过敏的诊断的“金标准”[20- 21]。

虽然目前所测人群较少，不能完全代表湖北省或华中地区鸡蛋过敏人群的组分蛋白种类，但对进一步临床科研提供方向，为今后食物过敏的诊断，乃至食物的脱敏治疗[22- 23]提供部分依据。

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