四甲基脲酸对镉损伤小鼠肝脏的保护作用

龚 频， 皮思慧， 杨文娟， 王 兰， 陈福欣

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.西安科技大学 化学与化工学院， 陕西 西安 710054)

四甲基脲酸对镉损伤小鼠肝脏的保护作用

龚 频1， 皮思慧1， 杨文娟1， 王 兰1， 陈福欣2*

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.西安科技大学 化学与化工学院， 陕西 西安 710054)

从元素镉、锌、铁、铜的变化水平研究四甲基脲酸对镉损伤小鼠肝脏的保护作用，采用小鼠腹腔注射CdCl2，连续处理14 d，测定肝脏元素镉、锌、铁、铜的含量.结果表明，镉在肝脏中蓄积呈极显著增加(###P<0.001)，同时影响锌含量显著减少(#P<0.05)，铁含量增加，铜含量无显著差异变化.四甲基脲酸可能通过清除过量自由基，降低了氧化损伤的程度，使元素含量呈现出剂量依赖，抑制镉和铁的增加，锌和铜含量减少.

四甲基脲酸； 镉； 微量元素； 氧化损伤

0 引言

重金属镉被广泛的应用于工业生产，极易通过食物链在人及动物体内蓄积，具有致癌、致畸和致突变作用.之前的研究表明镉的毒性作用能够诱导肝脏损伤[1]，寻找一种有效的防治镉的肝毒性药物迫在眉睫.四甲基尿酸(theacrine，TC)是一类具有嘌呤环的天然生物碱类物质，主要存在于普洱茶变种的苦茶嫩叶中[2].研究表明，四甲基脲酸具有抗抑郁、镇静催眠和抗炎镇痛的药理作用[3-5]，在化学、食品和医药方面引起了极大的反响.前期结果表明，四甲基脲酸对镉诱导的肝脏损伤具有一定保护作用，但保护机制尚未明确.本研究拟通过构建镉诱导小鼠肝脏损伤模型，结合元素镉、锌、铁、铜和谷胱甘肽、脂质过氧化的含量变化，从新角度探究四甲基脲酸对镉损伤小鼠肝脏保护作用的潜在机制，为苦茶产品的开发和深加工提供数据支持和理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

氯化镉(CdCl2)购自天津市福晨化学试剂厂；生理盐水购自西安双鹤制药有限公司；浓硝酸购自天津市河东区红岩试剂厂；浓盐酸购自北京化工厂；5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)购自Alfa Aesar公司，三氯乙酸、硫代巴比妥酸均购自上海山浦化工有限公司;其它试剂均为分析纯.

1.2 实验动物与模型构建

雄性昆明小鼠35只，购买自西安交通大学医学院实验动物中心，体重20±2 g.随机将小鼠分成5组，每组7只，给药方式按表1所示，CdCl2溶液浓度为2 mg/(kg·d)，胃饲不同浓度四甲基脲酸溶液.每天给药1次，持续给药14 d，四甲基脲酸浓度分别为10 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)，末次注射后禁食24 h，断颈处死解剖，取肝脏样品，保存于-70 ℃的冰箱中待用.

表1 构建镉损伤小鼠模型给药方式

注：CdCl2溶液浓度为2 mg/(kg·d).

1.3 小鼠脏器系数测定

小鼠处死前后，分别称量体重和肝脏的重量，按文献[6]中公式，计算肝脏脏器系数.

1.4 元素含量检测

使用干灰化法[7]进行样品前处理.准确称取待测肝脏组织，定性滤纸充分吸干水分，置于瓷坩埚中.马弗炉中500 ℃灰化6～8 h，过夜冷却，稀混酸充分溶解灰分.使用偏振塞曼原子吸收光度计，采用火焰法[8]测定镉、锌、铁、铜的标准曲线，同时检测样品中的镉、锌、铁、铜元素的含量(μg/g tissue).

1.5 酶学指标测定及方法

准确称量肝脏样品，制备成10%组织匀浆，采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)法测定还原型谷胱甘肽(GSH)[9]，硫代巴比妥酸法测定脂质过氧化指标丙二醛(MDA)含量[10].

1.6 数据统计学方法

所有的实验数据都表示为“mean ± SE”.平均值用单向方差分析法(one-way analysis of variance,ANOVA)和相应的t-检验进行统计学分析.统计学上P<0.05认为差异有统计学意义.

2 结果与讨论

2.1 镉损伤和四甲基脲酸保护对小鼠体重的影响

如图1所示，2 mg/(kg·d) CdCl2损伤14 d，使Cd组小鼠体重明显低于空白组(##P<0.01)，当四甲基脲酸剂量为10 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)时，给药第四天体重增长持续上升；镉损伤组从第六天开始呈下降趋势；而低、中剂量保护组第六天也呈下降趋势，第十二天下降趋势得到控制；这可能是保护药的浓度过低，并不能有效的抑制体内由镉竞争抑制金属元素带来的改变及氧化应激的作用[11].高剂量四甲基脲酸组明显抑制了下降趋势，并在保护药给予十天后呈现显著增加趋势(*P<0.05)，而低、中剂量四甲基脲酸组没有显著性差异.

2.2 镉损伤和四甲基脲酸保护对小鼠肝脏相对系数的影响

如图2所示，与空白组相比，镉损伤组脏器系数呈显著增加(##P<0.01).当四甲基脲酸的浓度为30 mg/(kg·d)时，能够抑制增加(*P<0.05).这是由于肝是机体中重要的解毒器官，任何药物或毒物进入体内后都要在其中进行代谢，肝脏脏器系数的升高可能是器官损伤的一种代谢补偿效应[12].

(n=7；与Control组相比，##P<0.01；与Cd-treatment组相比，*P<0.05)图1 镉损伤和四甲基脲酸保护对小鼠体重的影响

(n=7；与Control组相比，##P<0.01；与Cd-treatment组相比，*P<0.05)图2 镉损伤和四甲基脲酸保护对小鼠肝脏相对系数的影响

2.3 镉损伤和四甲基脲酸保护对小鼠肝脏中Cd、Zn、Fe、Cu的影响

CdCl2损伤14天，肝脏中元素含量的变化如图3所示.损伤组与空白组比较，镉的蓄积呈极显著(###P<0.001)增加，保护组与损伤组比较，镉含量有下降趋势，没有统计学意义；损伤组与空白组比较，锌含量减少，具有统计学意义(#P<0.05)，TC浓度为30 mg/(kg·d)时显著抑制其减少(*P<0.05)；损伤组与空白组比较，铁含量增加，没有统计学意义；TC浓度为10 mg/(kg·d)时，铁含量增加具有统计学意义(*P<0.05)，TC浓度为20、30 mg/(kg·d)，铁含量减少.铜含量在不同组别间没有显著性变化.

(n=7；与Control组相比，###P<0.001，#P<0.05；与Cd-treatment组相比，*P<0.05)图3 镉损伤和四甲基脲酸保护对小鼠肝脏中Cd、Zn、Fe、Cu的影响

体内的微量元素之间既有拮抗又有协同作用的存在，重金属镉的摄入对它们的影响是极其复杂的相互关系.镉在肝脏内的大量蓄积，使得镉置换出线粒体关键酶中的铁元素，从而干扰线粒体的正常功能，同时铁离子的游离，诱导体内发生Fenton反应，产生过量的氧自由基，诱导氧化应激的发生.镉通过活化黄嘌呤氧化酶、血红素氧化酶使机体内产生过量的超氧化自由基，消耗大量的锌离子参与抗氧化酶的合成，以减少机体的氧化损伤[13].

2.4 镉损伤和四甲基脲酸保护对小鼠肝脏中GSH和MDA的影响

谷胱甘肽作为机体内重要活性物质，具有清除自由基、促进铁质吸收等功能.脂质过氧化物是机体的氧化应激标志，其含量增加会影响细胞生长，导致蛋白质变性.如图4所示，镉损伤组与空白组相比，谷胱甘肽呈显著下降(##P<0.01)，脂质过氧化物呈增加趋势(#P<0.05)，有统计学意义；四甲基脲酸剂量为30 mg/(kg·d)时，抑制脂质过氧化物的增加趋势(*P<0.05)，谷胱甘肽在不同剂量保护下，没有显著性变化.

(a)谷胱甘肽

(b)脂质过氧化(n=7；与Control组相比，##P<0.01,#P<0.05；与Cd-treatment组相比，*P<0.05)图4 镉损伤和四甲基脲酸保护对小鼠肝脏中GSH和MDA的影响

3 结论

本实验通过构建镉损伤小鼠肝脏模型，从元素含量变化研究四甲基脲酸的保护作用.实验结果表明,肝脏内镉的累积增加了铁离子的含量，减少了锌、铜含量.四甲基脲酸通过清除过量产生的自由基，降低了氧化损伤的程度.为进一步阐明镉对肝脏毒性机制提供了新的思路，也为进一步开发苦茶中四甲基脲酸提供了数据支持.

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【责任编辑：蒋亚儒】

Protective effects of theacrine against cadmium-induced hepatotoxicity in mice

GONG Pin1, PI Si-hui1, YANG Wen-juan1, WANG Lan1, CHEN Fu-xin2*

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China； 2.School of Chemistry and Chemical Engineering, Xi′an University of Science and Technology, Xi′an 710054, China)

The elementals analysis on the level of cadmium,zinc,iron and copper in mice liver exposed to cadmium chloride (Cd(Ⅱ)) and the protective effect of theacrine against Cd(Ⅱ)-induced hepatic injury were investigated.After injected with CdCl2(ip) for 14 days,the oxidative damage of liver was evaluated through measurement of cadmium,zinc,iron,copper contents.The results showed that cadmium accumulated in the liver was significantly increased (###P<0.001),while the zinc content significantly reduced (#P<0.05),the iron content increased,the copper content shows no significant difference.Theacrine may clear the way by an excess of free radicals,reducing the degree of oxidative damage,so that the element content showed a dose-dependent inhibition of cadmium and iron increased tendency and reduce the downward trend in zinc and copper.

theacrine; cadmium; trace elements; oxidative damage

2016-12-17 基金项目：国家自然科学基金项目(21407104,81402815)

龚 频(1983-)，女，湖南邵阳人，副教授，博士，研究方向：药理生理

陈福欣(1981-)，男，河北吴桥人，副教授，博士，研究方向：天然产物化学，chenfuxin@xust.edu.cn

1000-5811(2017)02-0131-04

R99

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