蝙蝠葛叶总黄酮提取工艺优化及体外抗氧化活性研究

孔 阳， 马养民， 彭 欢

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021; 2.陕西科技大学 化学与化工学院， 陕西 西安 710021)

蝙蝠葛叶总黄酮提取工艺优化及体外抗氧化活性研究

孔 阳1， 马养民2， 彭 欢1

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021; 2.陕西科技大学 化学与化工学院， 陕西 西安 710021)

对超声波辅助提取蝙蝠葛叶总黄酮的最佳工艺条件以及总黄酮的抗氧化活性进行了研究.采用正交试验法筛选蝙蝠葛叶总黄酮最佳提取工艺.结果表明，最佳超声波提取工艺是功率150 W，乙醇浓度60%，料液比1∶20，提取时间60 min.抗氧化活性结果显示蝙蝠葛叶总黄酮具有较好的DPPH自由基清除能力.

蝙蝠葛; 黄酮; 正交试验法; 抗氧化活性

0 引言

蝙蝠葛(MenispermumdahuricumDC.)系防己科蝙蝠属植物，又名蝙蝠藤、山豆秧、黄条香、野

豆根等，为多年生草本攀缘植物.在我国主要分布于东北、华北、华中、华东等地，陕西省北部及秦岭北坡也有分布，多生于海拔1 500 m以下的田边或石砾滩地，《本草纲目拾遗》称其干燥根茎为“北豆根”[1,2].

研究表明，北豆根中含有蝙蝠葛碱、蝙蝠葛诺林碱、蝙蝠葛新诺林碱、蝙蝠葛可林碱、蝙蝠葛苏林碱、N-去甲基蝙蝠葛碱、粉防己碱、青藤碱等三十多种生物碱及异槲皮素、黄芪苷等多种黄酮类化学成分[3,4].北豆根性味苦寒，有小毒，具有清热解毒，消肿利咽，抗癌、祛风止痛等功效.临床广泛用于治疗癌症、咽喉肿痛、风湿痹痛、心脑血管疾病等病症[5-13].北豆根药用价值显著，原料的需求量很大.然而，人们只取其根部作药用却废弃茎叶部分，资源破坏严重.文献表明，蝙蝠葛茎叶中也含有黄酮类、生物碱、萜类等多种有效成分[14,15]，但是有关蝙蝠葛叶中总黄酮提取工艺的研究还未见报道.超声波作用于液体产生空化作用，能够使生物细胞壁破坏，从而加强细胞内物质扩散到溶剂中[16].因此本实验对超声波辅助提取蝙蝠葛叶总黄酮的最佳提取工艺进行研究，并对所得总黄酮的抗氧化活性进行了考察.

1 材料与方法

1.1 材料

蝙蝠葛于2015年8月采自西安翠华山，经杨文娟讲师鉴定为蝙蝠葛(MenispermumdauricumDC.)，新鲜的蝙蝠葛叶片经120 ℃杀青10 min后，在35 ℃烘干粉碎过20目筛备用.

1.2 仪器与试剂

(1)主要仪器：BILON-1000CT型多用途恒温超声波提取机(上海比朗仪器有限公司)，HF2000酶标仪(北京华安麦科生物技术有限公司)，S200 baygene移液枪(北京百晶生物技术有限公司)，3590 costar 96孔酶标板(美国Corning Costar公司)，HC-3618R型高速冷冻离心机(安徽中科仪器有限公司)，RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂).

(2)主要试剂：芦丁对照品(中国国药集团)，DPPH和维生素C(天津市博迪化工有限公司)，其余试剂均为分析纯.

1.3 超声波辅助提取总黄酮方法

1.3.1 超声提取工艺流程

蝙蝠葛叶粉→加入溶剂→超声波处理→离心→收集上清液→减压蒸馏→粗黄酮浸膏.

1.3.2 供试品溶液制备

精密称取阴干蝙蝠葛茎叶5 g，加入100 mL 60%乙醇，超声波提取60 min后过滤得滤液，定量转入100 mL容量瓶内，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液.

1.3.3 标准曲线的制备

精密吸取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 、6.0 mL置于25 mL容量瓶中，各加5% NaNO2溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加1% (ρ) AlCl3溶液3 mL，摇匀，放置6 min，加4% (ρ) NaOH溶液10 mL，摇匀，放置15 min，加水至刻度，第一个样品为空白对照，在510 nm波长处测定吸光度，以芦丁对照品的质量浓度(ρ)为横坐标，吸收度(A)为纵坐标作标准曲线，并进行线性回归.

1.3.4 稳定性试验

精密吸取对照品溶液与供试品溶液适量，按标准曲线项下操作显色，10 min后测定其吸光度，以不同的时间间隔测定样品的吸光度，观察其稳定性[17].

1.3.5 精密度试验

精密吸取供试品溶液0.5 mL，按标准曲线项下操作显色，测定吸光度5次，计算总黄酮得率，结果为2.54%，2.53%，2.54%，2.53%，2.54%，蝙蝠葛茎叶中总黄酮的平均得率为2.54%，RSD=0.19%.

1.3.6 样品总黄酮含量的测定

总黄酮含量以芦丁为对照品，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法测定[17-19],按照公式(1)计算总黄酮含量：

x=y×V×F/M

(1)

式(1)中：x—样品中总黄酮含量(mg/g);y—由回归方程算得的样液浓度(mg/mL);V—定容体积(mL);F—稀释倍数；M—样品量(g).

1.3.7 单因素考察

分别研究乙醇浓度、超声功率、提取时间、提取温度、料液比5个因素对蝙蝠葛总黄酮得率的影响.考察因素的选取范围，超声功率100～200 W，乙醇浓度0%～80%(V)，提取时间40～80 min，提取温度40 ℃～100 ℃，料液比1∶8～1∶24.

1.3.8 正交试验优选提取工艺

通过单因素考察，确定正交试验中提取温度设定在80 ℃,以保证得率并避免温度过高导致蝙蝠葛叶中部分黄酮类化合物在高温下分解.在单因素考察结果的基础上，确定乙醇浓度、超声波功率、提取时间、料液比四个因素作为得率的影响因子，设计L9(34)4因素3水平正交试验，筛选最佳提取工艺，如表1所示.

表1 正交试验因素水平表

1.4 抗氧化活性试验方法

以Vc作为参照，对蝙蝠葛叶总黄酮进行抗氧化性测试[20]，抗氧化性能强弱根据样品对DPPH自由基清除率来判断，清除率可由公式(2)进行计算：

(2)

式(2)中：E—自由基清除率，A0—DPPH和甲醇混合溶液吸光度，A1—第二排1-11孔所对应的吸光度，A2—第一排1-11孔所对应的吸光度.

按照公式(2)计算出不同样品浓度下的自由基清除率，以浓度为横坐标，清除率为纵坐标，绘制清除率变化曲线，对其增长部分进行线性拟合，按照拟合方程计算出样品对DPPH自由基率的IC50值，Vc按照同样方法进行检测.

2 结果与讨论

2.1 超声波辅助提取工艺优化结果

2.1.1 标准曲线

根据实验数据，以芦丁对照品的质量浓度(ρ)为横坐标，吸收度A为纵坐标得到标准曲线(如图1所示)，并进行线性回归，得到回归方程：

芦丁标准曲线线性回归方程为：

y=12.054x+0.000 5R2=0.999 8

y—对照品溶液吸光度，x—对照品溶液质量浓度，蝙蝠葛叶总黄酮浓度为0.01～0.07 mg/ml时呈良好的线性关系.

图1 标准曲线

2.1.2 稳定性试验结果

稳定性实验结果如图2所示，对照品芦丁与供试品在30 min之内稳定性良好，但随着时间的延长，供试品的吸光值均逐渐减小， 40 min后，供试品吸光值显著降低，说明供试品较对照品更不稳定，因此吸光值的测定应在30 min以内完成.

图2 稳定性实验结果

2.1.3 单因素考察结果

(1)超声波功率对得率的影响

超声波功率对蝙蝠葛叶总黄酮得率的影响如图3所示，蝙蝠葛叶中总黄酮的得率随超声波功率的增大而明显增大，在200 W处达到了最大值.

图3 超声波功率对得率的影响

(2)乙醇浓度对得率的影响

乙醇浓度对蝙蝠葛叶总黄酮得率的影响如图4所示.总黄酮的得率随乙醇浓度的升高明显增加，在乙醇浓度60%处得率达到最大，之后逐渐降低.

图4 乙醇浓度对得率的影响

(3)料液比对得率的影响

料液比对得率的影响结果如图5所示.蝙蝠葛叶中总黄酮的得率随料液比的增加而逐渐增加，当料液比达到1∶20后，得率变化不大，同时考虑到料液比过高会增加后期药液浓缩的难度，因此在正交试验中设定三个水平为1∶10、1∶15、1∶20.

图5 料液比对得率的影响

(4)提取时间对得率的影响

提取时间对得率的影响如图6所示.蝙蝠葛叶中总黄酮的得率随提取时间的延长而增加，80 min时得率最大，之后随着时间的增加得率有所下降.

图6 提取时间对得率的影响

(5)提取温度对得率的影响

提取温度对得率的影响如图7所示.随着提取温度的升高，蝙蝠葛茎叶中总黄酮的得率随之上升且增加幅度较大，80 ℃时得率最高，温度继续升高时得率有所下降，分析其原因可能是由于温度过高会影响总黄酮的稳定性，因此在正交试验考察中选用80 ℃为提取温度，以避免温度过高导致部分黄酮类化合物分解.

图7 温度对得率的影响

2.1.4 正交试验法优选提取工艺

精密称取蝙蝠葛茎叶5 g，按表1 L9(34)正交试验因素水平表对蝙蝠葛茎叶进行超声波提取工艺优化，结果如表2所示.

表2 正交试验结果

从极差分析表明，最佳的提取工艺为A3B2C3D3，所考察的因素影响程度为：乙醇浓度>超声波功率>提取时间>料液比.对正交试验结果进行验证试验，在条件A3B2C3D3下提取3次，总黄酮的得率分别是：3.70%、3.69%、3.67% ，平均得率为3.69%与正交试验结果相符.

方差分析结果如表3所示，超声波功率和乙醇浓度对黄酮得率影响显著(显著性水平α=0.05)，而料液比和提取时间的影响不显著.综合比较得最佳工艺为超声波功率250 W，乙醇浓度60%，料液比1∶20，提取时间80 min.

表3 正交试验及结果

2.2 蝙蝠葛叶总黄酮体外抗氧化活性测试结果

将提取得到的蝙蝠葛叶总黄酮进行体外抗氧化活性试验，以Vc作对照，结果如表4所示.从表4可以看出，蝙蝠葛叶总黄酮对DPPH的自由基清除率IC50值(μg/mL)与维生素C相当，具有较好抗氧化活性.

表4 DPPH自由基清除率测试结果

3 结论

本实验结果表明蝙蝠葛茎叶含有较为丰富的黄酮类化合物，具有较好的体外抗氧化活性，是良好的天然抗氧化剂.同时本文优选出了最佳的超声波提取工艺，为进一步开发利用蝙蝠葛资源提供了参考依据.

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【责任编辑：陈 佳】

Study on optimum extraction and antioxidative activity of total flavonoids from the Leaf ofMenispermumdahuricumDC.

KONG Yang1， MA Yang-min2， PENG Huan1

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 2.College of Chemistry and Chemical Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

The paper is about the ultrasonic assisted extraction optimum process conditions and antioxidative activity of total flavonoids from Leaves ofMenispermumdahuricumDC.Orthogonal test method was used to select the optimum extraction technology.The results show the optimal process is power 150 W,ethanol concentration 60%,solid-liquid ratio 1∶20,extraction time 60 min.Antioxidant activity results show that the total flavonoids has good DPPH radical scavenging capacity.

MenispermumdahuricumDC.; flavonoids; orthogonality; antioxidative activity

2016-12-15 基金项目：陕西省教育厅自然科学专项科研计划项目(2013JK0726)

孔 阳(1980-)，女，山东曲阜人，讲师，在读博士研究生，研究方向：天然产物化学

1000-5811(2017)02-0121-05

R284.2

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