复方钩藤降压片对自发性高血压大鼠心脏重构的保护作用及机制探讨*

陈偶英谭元生△何诗雯简维雄张 稳曾 勇杨玉佩

（1．湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2．湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

·研究报告·

复方钩藤降压片对自发性高血压大鼠心脏重构的保护作用及机制探讨*

陈偶英1谭元生1△何诗雯2简维雄1张 稳2曾 勇2杨玉佩1

（1．湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2．湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

目的探讨复方钩藤降压片对自发性高血压大鼠心脏重构的保护作用及机制。方法将24只14周龄雄性SHR大鼠随机分为SHR空白组、复方钩藤降压片组、替米沙坦组，另纳入8只同周龄雄性WKY大鼠为正常对照组，干预持续12周。采用无创尾动脉法观察复方钩藤降压片对SHR的降压作用；放免分析法测定血浆白介素-1β（IL-1β）、白介素-10（IL-10）含量；Masson染色观察心脏组织的形态学变化；免疫组化法检测心肌细胞IL-1β、IL-10蛋白表达变化；Western blot法检测心肌细胞IL-1β、IL-10蛋白表达水平。结果与SHR空白组比较，复方钩藤降压片可明显降低血压（P＜0.01）；与SHR空白组比较，替米沙坦组及复方钩藤降压片组大鼠IL-1β降低，IL-10升高（P＜0.01）；与替米沙坦组比较，复方钩藤降压片组大鼠IL-1β降低（P＜0.05）；与SHR空白组相比，复方钩藤降压片组、替米沙坦组心肌间质胶原增生明显减轻；各组大鼠心肌组织蛋白表达体视学图像积分光密度分析，复方钩藤降压片组IL-1β低于替米沙坦组 （P＜0.05）；Western-BIot法检测心肌细胞蛋白表达水平，IL-1β半定量检测结果比较，复方钩藤降压片组、替米沙坦组均低于SHR空白组（P＜0.01）；复方钩藤降压片组低于替米沙坦组（P＜0.05）；IL-10半定量检测结果比较，复方钩藤降压片组、替米沙坦组均高于SHR空白组（P＜0.05）。结论复方钩藤降压片对SHR心脏重构具有保护作用，其干预机制可能与降低SHR血浆与心脏组织中IL-1β含量，增高IL-10含量有关。

复方钩藤降压片 炎症因子 自发性高血压 心脏重构

现代研究认为高血压可能是一种慢性炎症性疾病［1］。动物实验发现，自发性高血压大鼠（SHR）体内存在着炎症细胞的激活，炎症细胞激活参与了左室肥厚等心血管重构过程［2］。我们前期的研究发现28周龄自发性高血压大鼠血压显著升高，同时心肌发生明显重构［3］。但心脏重构与炎症之间关系尚不明确。本实验以SHR为实验动物，采用中药复方钩藤降压片治疗，以探讨SHR心脏重构与IL-1β、IL-10的关系，以及中药对SHR心肌重塑的保护作用，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 12周龄雄性SHR 28只，体质量180～220 g，SPF级。同龄血压正常的 Wistar Kyoto大鼠（WKY）9只，雄性，体质量180～220 g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001。实验动物环境设施合格证号：SYXK（湘）2009-0001。

1.2 药物与仪器 复方钩藤降压片，由湖南中医药大学第一附属医院提供，规格：0.4 g/片，批号：130317，组成为钩藤、川芎、麦冬。替米沙坦片剂（邦坦），由江苏万郑生化医药股份有限公司提供，规格：40 mg×16片，国药准字：H20050715。4%甲醛溶液，上海标本模型厂生产，批号：20140213。戊巴比妥钠，北京化学试剂公司，批号：130424，规格：25 g/瓶。白介素1β（IL-1β）、白介素10（IL-10）酶联免疫分析测定盒均购自武汉市博士德生物科技公司，批号：201403。羊抗兔HRP标记二抗，购自碧云天生物技术研究所，货号：A0208。丽春红S，购自上海基尔顿生物公司，货号：BYL40635。主要仪器：BP-98A智能无创血压计，日本Olympus公司生产；AO820型病理切片机，日本Histo STAT公司生产；MK3酶标仪，芬兰雷勃公司生产；PS-9型电转仪，大连竞迈科技有限公司生产。

1.3 分组与给药 饲养2周（第14周）后采取无创尾动脉测压，剔除血压最低SHR大鼠及WKY大鼠各1只，随机选取3只SHR大鼠进行心脏组织病理学的检查，对符合LVH标准的SHR随机分成3组，每组8只，再另将WKY大鼠8只设为正常对照组。替米沙坦组按照3.6 mg/（kg·d）给药；复方钩藤降压片按照3.575 mg/（kg·d）给药。所有药物均采用无菌用水配置所需质量浓度，每日8∶00按照10 mL/kg灌胃给药1次，连续用药12周，SHR空白组与对照组均给予同体积无菌用水。

1.4 标本采集与检测 1）血压：各组于灌胃后开始监测血压，每周测量1次。测量环境安静、恒温（26℃），相对湿度20%～30%，在清醒与非激怒状态下测量大鼠收缩压，连续测量4次，取均值。2）IL-1β、IL-10：连续给药12周，最后一次给药完毕采取禁食不禁水24 h，即予腹主动脉取血，分离血浆，用放射免疫法测定各组血浆IL-1β、IL-10含量。3）心肌组织：给药周期结束后处死动物后迅速取出大鼠心脏组织，使用预冷PBS溶液清洗心腔内残留血液，清除非心肌组织（血管及脂肪等），左心室中部沿冠状面取连续2块厚约2～3 mm的心肌组织；常规石蜡包埋后，每个组织做连续切片。分析方法：采用Masson染色，进行光镜观测；根据免疫组化方法（PV9000法）进行抗原修复、苏木素复染、二甲苯脱水透明，中性树胶封片，采取图像分析与统计学处理将免疫组化切片输入SEM-IPS图像分析系统，表达阳性细胞为胞核和胞浆内黄棕色颗粒，在图像分析系统下，于每一玻片高倍视野（400）下任取5个视野内共200个细胞计算阳性细胞数及阳性信号平均灰度值以检测心肌细胞 IL-1β、IL-10蛋白表达变化；根据Western blot法，进行蛋白定量、PAGE胶的制备、上样及电泳、转膜、膜上蛋白的检测、膜的封闭及抗体孵育、显色以检测心肌细胞IL-1β、IL-10蛋白表达水平。

1.5 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件分析。计量资料以（s）表示，血压、血浆炎性因子实验前后数据比较采用t检验，组间比较采用方差分析；图像分析两组间比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组给药前后血压比较 见表1。与WKY组比较，SHR空白组大鼠血压明显升高（P＜0.01）；随着时间的延长，血压进一步增高；与SHR空白组比较，替米沙坦组及复方钩藤降压片组血压均明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；与替米沙坦组比较，复方钩藤降压片组血压差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组IL-1β、IL-10含量比较 见表2。与WKY组比较，SHR空白组大鼠IL-1β增高，IL-10降低（P＜0.01）；与SHR空白组比较，替米沙坦组及复方钩藤降压片组大鼠IL-1β降低，IL-10升高，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）；与替米沙坦组比较，复方钩藤降压片组大鼠IL-1β降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组给药前后血压比较（mmHg，s）

表1 各组给药前后血压比较（mmHg，s）

与WKY组比较，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01；与SHR空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与本组给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与替米沙坦组比较，□P＜0.05。下同。

组别 n 给药前 给药后4周 给药后8周 给药后12周WKY组 8 SHR空白组 8复方钩藤降压片组 8 121.45±8.66 122.13±7.81△△121.05±10.67△△120.71±8.97△△192.32±10.67◇◇204.46±12.68*228.54±10.69*239.61±11.24**193.27±9.10◇◇180.07±10.43△*176.38±12.01△△**164.51±9.27△△**替米沙坦组 8191.86±12.95◇◇176.37±9.98△*169.47±11.92△△**163.47±10.49△△**

表2 各组IL-1β、IL-10含量比较（ng/L，s）

表2 各组IL-1β、IL-10含量比较（ng/L，s）

组别 n IL-1β IL-10 WKY组 8 SHR空白组 8复方钩藤降压片组 8 47.58±1.44△△62.78±2.74△△74.54±2.37△△41.65±2.25 54.34±3.24△△□52.08±1.81△△替米沙坦组 860.53±3.08◇◇△△50.66±1.96△△

2.3 各组心肌细胞组织学病理的影响 见图1。Masson染色（光镜下可见），WKY组心肌间质胶原无增生；SHR空白组部分心肌纤维坏死，心肌间质胶原增生明显；复方钩藤降压片组心肌间质胶原轻度增生；替米沙坦组心肌纤维排列较整齐，心肌间质胶原稍增生。

图1 各组心肌细胞组织学病理的影响

2.4 各组心肌组织IL-1β、IL10免疫组化检测结果（PV9000法） 上样顺序及结果见图2，图3。棕黄色为IL-1β在大鼠心肌中的表达；A组为26周龄WKY组，棕黄色不明显；B为26周龄SHR空白组，棕黄色表达呈现中度偏强阳性；C、D组分别为26周龄SHR复方钩藤降压片组和替米沙坦组心肌中IL-1β表达，C组棕黄色颗粒稍增高，呈弱阳性表达，D组棕黄色颗粒增多明显，呈中度阳性表达。棕黄色为IL-10在大鼠心肌中的表达；A组为WKY组，棕黄色明显，呈强阳性表达；B中为26周龄SHR空白组，棕黄色表达呈弱阳性；C、D组分别为26周龄SHR复方钩藤降压片组和替米沙坦组心肌中IL-10表达，棕黄色颗粒均增高，但C组棕黄色颗粒增多更加显著，呈强阳性。

图2 各组心肌组织IL-1β免疫组化检测结果（PV9000法）

图3 各组心肌组织IL-10免疫组化检测结果（PV9000法）

2.5 各组大鼠心肌组织IL-1β、IL-10蛋白表达体视学图像积分光密度分析 见表3。各组大鼠心肌组织IL-1β比较：与WKY组相比，SHR空白组明显升高（P＜0.01）；与SHR空白组相比，复方钩藤降压片组、替米沙坦组均明显减低（P＜0.01）；复方钩藤降压片组低于替米沙坦组（P＜0.05）。各组大鼠心肌组织IL-10比较：与WKY组相比，SHR空白组、替米沙坦组均降低（P＜0.05或P＜0.01）；与SHR空白组相比，复方钩藤降压片组、替米沙坦组均明显升高（P＜0.01）；复方钩藤降压片组高于替米沙坦组，差异无统计学意义（P>0.05）。

表3 各组大鼠心肌组织IL-1β、IL-10蛋白表达体视学图像积分光密度分析（s）

组别 n IL-1β IL-10 WKY组 8 SHR空白组 8复方钩藤降压片组 8 1.09±0.16 6.77±0.16 3.17±0.14◇◇1.48±0.14◇◇1.51±0.21△△□6.23±0.58◇◇△△替米沙坦组 82.25±0.21△△5.33±0.10◇◇△

2.6 各组大鼠心肌组织IL-1β、IL-10蛋白表达水平、分析 见表4和图4。IL-1β半定量检测结果比较，SHR空白组、替米沙坦组均高于WKY组（P＜0.05或P＜0.01）；复方钩藤降压片组、替米沙坦组均低于SHR空白组（P＜0.01）；复方钩藤降压片组低于替米沙坦组（P＜0.05）。IL-10半定量检测结果比较，SHR空白组低于WKY组 （P＜0.05），复方钩藤降压片组、替米沙坦组均高于SHR空白组（P＜0.05）；复方钩藤降压片组高于替米沙坦组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组大鼠心肌组织IL-1β、IL-10通路蛋白表达的半定量分析（mmHg，s）

组别 n IL-1β IL-10 WKY组 8 SHR空白组 8复方钩藤降压片组 8 0.46±0.03 0.56±0.09 2.36±0.61◇◇0.31±0.02◇0.69±0.04△△□0.63±0.05△替米沙坦组 81.13±0.38◇△△0.58±0.06△

3 讨 论

SHR与临床高血压病患者在发病机制、病理生理过程方面最接近，是研究人类高血压病心血管重构的重要动物模型［4］。SHR体内存在着炎症细胞的激活，炎症细胞激活参与了心血管重构过程［2］。炎性细胞因子是一类与炎症有关的细胞因子，由免疫细胞和某些非免疫细胞产生和分泌，可通过免疫调节，参与细胞生长、分化、修复和免疫过程。在高血压病机体内，炎症细胞如巨噬细胞被活化，可引起多种炎性细胞因子的释放，这些炎性细胞因子相互作用，通过免疫调控网络参与［5］。炎性细胞因子又可分为促炎性因子和抗炎性因子。IL-1β是最重要的促炎性因子之一，介导炎症反应，作为炎症信使能促进吞噬细胞杀伤作用［6］。IL-1β在心肌细胞上的异常表达，刺激各种生长因子的表达，高血压时压力负荷增加可引发心肌中IL-1βmRNA转录及蛋白质合成增加，进入血液循环进一步刺激心脏重构产生［7-8］。IL-10是一种具有多种生物学活性的细胞因子，可抑制炎症免疫反应、调节免疫，并明显抑制血管平滑肌细胞增殖，调节细胞外基质的降解，通过对血管细胞外基质及血管平滑肌细胞的影响，可通过多种途径预防、延缓甚至逆转左心室重构［9-11］。

替米沙坦是欧洲药品评审局（EMEA）和美国食品药品管理局（FDA）批准，唯一具有全面心血管保护适应证的ARB药物［12］，但LVH的流行仍远未达到理想控制。复方钩藤降压片系临床经验方制备药物，专利号：20101010856．X，其组方独特，药味精简，临床用于治疗高血压左心室肥厚患者疗效确切［13-14］。复方钩藤降压片中钩藤主要成分为吲哚类生物碱及黄酮类化合物等，具有调节血管活性物质，升高一氧化氮（NO），降低内皮素（ET）和AngⅡ，降低LVMI和胶原含量，改善心室重构作用［15-16］。川芎的主要化学成分为挥发油、生物碱、酚性物和有机酸酯类等，降血压的主要活性物质为川芎嗪、川芎素。川芎嗪既能扩张冠状动脉，增加血流量，降低心肌的耗氧量，以改善心肌的血氧供应；又具有扩张脑血管，降低血管阻力，显著增加脑及肢体血流量，改善微循环等作用，还能明显抑制吗啡戒断大鼠的血压升高、明显抑制血管收缩、舒张血管平滑肌、降低细胞的兴奋性。川芎素水煎剂对动物中枢神经系统具有镇静和明显而持久的降压作用［17］，同时具有抑制炎性因子表达从而达到抗炎抗增殖作用［18］。麦冬主要化学成分为甾体皂苷、多糖、高异黄酮类、氨基酸及微量元素等，能显著提高实验动物耐缺氧能力，增加冠脉流量，对心肌缺血有明显的保护作用，并能抗心律失常、改善心肌收缩力、抗血栓形成、改善微循环及左心室功能与抗休克等作用，麦冬中提取到的多种类型化合物（如皂苷黄酮呋喃等）都有抗炎功效，发挥功效的途径为抑制炎症介质的释放嗜酸细胞细胞活化趋化因子的释放和嗜中性粒细胞呼吸爆发等［19］。

本研究观察到，与14周龄WKY大鼠比较，同周龄SHR已形成高血压，并出现了明显的心脏重构，且SHR随着高血压发病时间的延长，心脏重构进行性加重，同时伴有心肌IL-1β致炎因子表达的增加，IL-10抗炎因子表达减弱，表明免疫-炎症反应确实参与了SHR心脏重构的发展。同时发现复方钩藤降压片组与替米沙坦组治疗后心脏重构改善，而心肌局部炎性细胞因子也呈IL-1β降低、IL-1β升高趋势，推测复方钩藤降压片组与替米沙坦组大鼠心脏重构的改善，可能与心肌局部免疫炎症水平的改变有关。其中复方钩藤降压片组IL-1β降低较替米沙坦组更加明显，结合前期及本实验研究结果，我们认为复方钩藤降压片对SHR心脏重构具有保护作用，与抑制心脏局部炎症有关。复方钩藤降压片组IL-10升高较替米沙坦组增高，但无统计学意义，可能是标本量较少原因。

综上所述，复方钩藤降压片通过多种有效成分的合理组合，多途径地作用于心脏重构相关靶点，发挥对机体系统的协调作用，在形态学可明显改善心脏重构。

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Influence of the Fufang Gouteng Tablet on Inflammatory Factors Induced Cardiac Remodeling in Spontaneously Hypertensive Rats

CHEN Ouying，TAN Yuansheng，HE Shiwen，et al. Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China.

Objective：To investigate the influence of the Fufang Gouteng Tablet on inflammatory factors induced cardiac remodeling in spontaneously hypertensive rats.Methods：24 male SHR were randomly divided into the SHR blank group，the Fufang Gouteng Tablet group，the telmisartan group.Meanwhile，8 WKY male rats were in the normal control group.After drugs for 12 weeks，the influence of the Fufang Gouteng Tablet on SHR was measured by noninvasive caudal artery method.The blood pressure，the levels of interleukin-1β（IL-1β）and interleukin-10（IL-10）in blood were measured by radioimmunoassay.The SHR heart morphological changes were observed by Masson dyeing.The methods of immunohistochemistry and Western-BIot were used to detect the expression level of IL-1 beta and IL-10 in cardiac muscle cells.Results：Compared with the SHR blank group，the Fufang Gouteng Tablet group could significantly reduce blood pressure（P＜0.01）.Compared with the SHR blank group，the Fufang Gouteng Tablet group and the telmisartan group′s plasma inflammatory factors IL-1β content were reduced and the inflammatory factors IL-10 were increased（P＜0.01）.Compared with the telmisartan group，the IL-1β in the Fufang Gouteng Tablet group was reduced（P＜0.05）.Compared with the SHR blank group，the myocardial interstitial collagen hyperplasias of the Fufang Gouteng Tablet group and the telmisartan group were significantly reduced.According to the image analysis of integral optical density of stereological protein expression in myocardial tissue of rats，the IL-1β in the Fufang Gouteng Tablet group was lower than that in the telmisartan group（P＜0.05）.According to the Myocardial cell protein expression level by Western bIot method.The comparison of semi quantitative detection results indicated the IL-1β of the Fufang Gouteng Tablet group and the telmis-artan group was lower than the SHR group （P＜0.01）.The Fufang Gouteng Tablet group was lower than the telmisartan group on the level of IL-1β（P＜0.05）.The IL-10 of the Fufang Gouteng Tablet group and the telmisartan group was higher than that of the SHR group（P＜0.05）.Conclusion：The SHR cardiac remodeling can be improved by the Fufang Gouteng Tablet，the protect mechanism may be related to reducing SHR plasma IL-1β content，increasing IL-10 content.

Fufang Gouteng Tablet；Inflammatory factors；Spontaneous hypertensive rats；Cardiac remodeling

R285.5

A

1004-745X（2017）03-0377-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.001

2016-08-21）

国家自然科学基金项目（81473616）；湖南省科学技术厅科技计划重点项目（2013SK2025）

△通信作者（电子邮箱：1812745152@qq.com）