枸地氯雷他定对小鼠变应性接触性皮炎中Th1/Th2的影响

王 玉 刘 静 薛亚东 田 静



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枸地氯雷他定对小鼠变应性接触性皮炎中Th1/Th2的影响

王 玉 刘 静 薛亚东 田 静

目的： 明确枸地氯雷他定对变应性接触性皮炎(ACD)小鼠耳廓肿胀程度的抑制作用以及对Th1/Th2相关细胞因子水平的影响。方法： 建立ACD小鼠模型，观察口服不同剂量(1 mg/kg，2 mg/kg，3 mg/kg，4 mg/kg)枸地氯雷他定对ACD小鼠耳廓肿胀的抑制作用(应先造模，后饲药物)，采用ELISA 法检测小鼠血清中IL-4、IFN-γ,TNF-α的水平。结果： 口服各剂量枸地氯雷他定均能明显抑制ACD小鼠的耳廓肿胀程度， 且具有剂量依赖性。模型组血清IFN-γ,IL-4,TNF-α水平明显高于正常对照组(P<0.01)，药物干预后血清IFN-γ,IL-4,TNF-α水平呈剂量依赖性下降。结论： 枸地氯雷他定可能通过调节Th1/Th2相关细胞因子IFN-γ,IL-4,TNF-α水平对ACD小鼠的治疗发挥作用。

枸地氯雷他定； 变应性接触性皮炎； 干扰素γ; 肿瘤坏死因子α; 白介素4

特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)，是一种常见、具有高度遗传倾向的瘙痒性皮肤病。通常与过敏性鼻炎和哮喘等过敏性疾病相关。其特征是皮肤干燥、瘙痒剧烈，反复发作。可因感染、精神压力、气候变化、刺激物和过敏原等因素而加重。瘙痒常夜间加重，导致睡眠不足，严重影响病人的生活质量。近年来，有关AD 的基础和临床研究日益深入，研究表明本病与免疫失调有密切关系，存在细胞因子网络异常等[1]。细胞因子网络失衡可能是发病机制中的重要组成部分。在疾病状态下，Th1/Th2的动态平衡被打破，偏向于Th1优势应答或 Th2优势应答，与自身免疫病、过敏性疾病、肿瘤、移植排斥反应以及感染性疾病的发生与发展有密切关系。本研究通过构建变应性接触性皮炎(ACD)小鼠模型，检测枸地氯雷他定喂食前后干预小鼠Th1/Th2细胞相关细胞因子(IL-4、IFN-γ,TNF-α)水平的变化情况，观察其是否可能通过干预细胞合成及分泌环节，影响Th1/Th2细胞的平衡。

1 材料和方法

1.1 实验动物 48只7周龄SPF级雌性Balb/c小鼠，体重17～19 g，购自于维通利华(许可证号：SCXK(京)2006-0009)。饲养于SPF级动物房，实验动物进行适应性喂养1周后进行实验，期间自由饮水、摄食，环境温度控制在(23±3)℃，湿度控制在40%～70%。为了确保统计学分析的有效性，在实验分组中每个实验组有8只小鼠。

1.2 主要试剂 2,4-二硝基氟苯(DNF，西亚试剂，分析纯)，丙酮(上海高东化工实业有限公司，分析纯)， 枸地氯雷他定(扬子江药业集团广州海瑞药业有限公司)，IL-4、IFN-γ,TNF-α(武汉博士德生物工程有限公司)，氯化钠(北京化学试剂公司，分析纯)

1.3 仪器设备 分析天平(上海越平科学仪器有限公司)，微量进样针(上海安亭微量进样器厂)，SIGMA 1-14小型台式离心机(德国SIGMA公司)一次性无菌注射器(1 mL，常州市远东医疗器械有限公司)

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠ACD模型的建立 用DNFB丙酮橄榄油溶液(丙酮-橄榄油4∶1)致敏和激发小鼠皮肤建立小鼠变应性接触性皮炎(ACD)模型。Balb/c小鼠正常饲养与SPF屏障系统内1周，于实验前1天在腹部用脱毛膏脱毛，范围约3 cm×3 cm，实验第1天脱毛部位用微量进样针均匀涂以1% DNFB丙酮橄榄油溶液50 μL致敏，实验第2天重复强化致敏1次。实验第7天，小鼠右耳滴涂1 % DNFB丙酮橄榄油溶液10 μL进行激发，左耳滴涂丙酮橄榄油(丙酮-橄榄油4∶1)溶液10 μL作为对照。空白组在相同部位仅涂以丙酮橄榄油溶液(4∶1)10 μL作对照。诱发后24小时鼠耳出现明显的红斑、肿胀，认为建模成功。

1.4.2 分组及给药 将48只小鼠按体重随机分为6组，每组8只，分别为空白组、模型组、治疗组(枸地氯雷他定1，2，3，4 mg/kg)，小鼠按上述分组方法于致敏后每日灌胃受试物0.2 mL，模型组给予等体积的生理盐水。造模成功并采集数据后，各组动物以摘眼球法取血，收集血液于EDTA 抗凝管中，2000 r/min，离心15 min， 取血清于-70℃ 冰箱保存用于细胞因子检测。随后颈椎脱臼处死，取下小鼠双耳于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.4.3 耳厚度差 在激发后24 h以游标卡尺测量小鼠双侧耳中部的厚度，计算诱发后左右耳厚度差。

1.4.4 细胞因子水平分析 ELISA检测：用ELISA试剂盒，按照试剂盒说明书检测血清IFN-γ、IL-4、TNF-α水平，分析治疗前后细胞因子水平的变化情况。

2 实验结果

2.1 小鼠ACD模型的建立 激发24 h后，模型组小鼠耳肿胀度明显，空白组小鼠耳部几乎不肿胀。模型组与空白组有显著性差异(P<0.01)。见图1。

图1 模型组小鼠耳肿胀度

2.2 枸地氯雷他定对小鼠耳肿胀度的影响 见表1。小鼠耳部激发24 h后模型组小鼠耳肿胀度明显(P<0.01)。与模型相比，不同剂量的枸地氯雷他定不同程度地抑制了小鼠耳肿胀程度，其中高剂量组与模型组有显著性差异(P<0.05)。表明枸地氯雷他定能够减轻小鼠ACD模型耳肿胀度，且具有剂量依赖性。

表1 枸地氯雷他定对小鼠耳肿胀度的影响mm

注：☆P<0.01 vs空白对照组；*P<0.05 vs模型组；n=8

2.3 枸地氯雷他定对过敏性接触性皮炎模型小鼠血清细胞因子的影响 采用ELISA法检测血清IFN-γ、IL-4、TNF-α水平，模型组和正常对照组比较，血清IFN-γ、IL-4、TNF-α水平有明显的升高(P<0.01)。药物干预后血清IFN-γ、IL-4、TNF-α水平呈剂量依赖性下降趋势，表明枸地氯雷他定能够减轻小鼠ACD模型血清IFN-γ、IL-4、TNF-α等炎症因子的改变。见表2。

表2 枸地氯雷他定对ACD模型小鼠血清细胞因子的影响 pg/mL

注：☆P<0.01 vs空白对照组；*P<0.01 vs模型组；n=8

3 讨论

研究表明在AD中存在着多层次T细胞活化和广泛的细胞因子网络失衡，Th细胞是细胞因子的重要来源，所分泌的细胞因子被分为两大类：Th1细胞与Th2细胞。Th1细胞主要分泌TNF-α、IFN-γ、IL-12,Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等。Th1、Th2型细胞发挥着不同的功能，在机体免疫中起不同作用。Th1细胞与迟发型超敏反应性T细胞(TDTH细胞)和细胞毒性T细胞(CTL)的增殖、分化、成熟有密切关系，可增强杀伤细胞的细胞毒性作用，激发迟发型超敏反应，介导细胞免疫应答。Th2型细胞与B细胞的增殖、成熟和抗体生成有关，可增强抗体介导的体液免疫应答。这两类细胞因子的作用不同，且通常相互对抗。在疾病状态下，Th1/Th2的动态平衡被打破，偏向于Th1优势应答或Th2优势应答，与自身免疫病、过敏性疾病等的发生与发展有密切关系。目前AD被认为主要是由Th2细胞介导的迟发型超敏反应所致，IL-4刺激和活化B细胞,刺激T细胞增殖及促进IgG向IgE类型转化,因而是Th2型最具代表性的细胞因子，IFN-γ主要由活化的Th1亚群产生,被认为是促使T辅助细胞向Th1分化的始动因素，大量的IFN-γ能够刺激皮肤常驻细胞如角质形成细胞和真皮成纤维细胞产生大量的细胞因子和趋化因子，从而引起外周炎性细胞对表皮和真皮的浸润。枸地氯雷他定属于第三代抗组胺药物，为地氯雷他定与枸橼酸氢二钠结合形成，由于水溶性提高， 能在体内快速分解为地氯雷他定而起作用。体内外实验显示枸地氯雷他定除具有高效的抗过敏作用外，人体药代动力学研究表明枸地氯雷他定血药浓度达峰更快[3，4]。能选择性地拮抗外周H1受体，抑制肥大细胞释放组胺，同时还能有效抑制炎症初期及进展期多个环节炎性介质及其释放，减少嗜酸粒细胞趋化。

本研究通过在实验小鼠腹部脱毛并使用DNFB丙酮橄榄油溶液反复刺激，成功建立小鼠ACD模型，进一步研究了枸地氯雷他定对模型耳部红肿程度，血清炎性细胞因子水平的影响，结果显示枸地氯雷他定能够减轻模型耳部肿胀度和抑制模型皮肤水肿形成。血清IFN-γ，IL-4,TNF-α细胞因子检测显示诱发后血清IFN-γ，IL-4,TNF-α水平均明显升高，枸地氯雷他定各剂量组对IFN-γ，IL-4,TNF-α均有明显抑制作用,大量的IFN-γ能够刺激皮肤常驻细胞如角质形成细胞和真皮成纤维细胞产生大量的细胞因子和趋化因子，从而引起外周炎性细胞对表皮和真皮的浸润，枸地氯雷他定明显降低血清IFN-γ水平，从而减少了皮肤炎症因子的级联反应。从给药前后各细胞因子变化的比值来看，模型组的比值低于正常，提示Th2细胞占优势，给药治疗后比值上升，提示Th1型逐渐占优势。出现这种变化趋势的可能原因是：在ACD发展过程中I型和II型T细胞因子在病变的不同时期交互出现，有时相互促进，有时相互抑制。Th1/Th2细胞因子的平衡或偏移，可能取决于抗原的特性、接触途径、剂量和频率，并影响着ACD损伤的急、慢性发展。本研究中用化学物质引起的ACD是典型的迟发型变态反应，过敏个体之所以呈现出不同的细胞因子反应模式可能与致敏原在致敏和激发过程的接触途径有关，也可能是不同的化学物质诱导Th1或Th2型细胞因子表达，或两者协同表达的能力不同。化学品诱导的ACD可能不单纯是典型的IV型变态反应，致敏化学品的刺激特性与过敏特性共存在ACD发展过程中的作用也很重要。

[1] 吴忠,李宏.特应性皮炎的免疫学发病机制[J].中华临床免疫和变态反应杂志,2008,4(2):291-296.

[2] Tworek D, Bochenska-Marciniak M, Kupczyk M, et al. The effect of weeks treatment with desloratadine (5mg daily) on levels of interleukin (IL)-4, IL-10, IL-18 and TGF beta in patients suffering from seasonalAllergic rhinitis[J]. Pulm Pharmacol Ther,2007,20(3):244-249.

[3] Bachert C, van Cauwenberge P. Desloratadine for intermittent and persistent allergic rhinitis:a review[J]. Clin Ther,2007,29(9):1795-1802.

[4] Reinartz SM, Overbeek SE, Klejnjan A, et al. Desloratadin treatment reduces systemic allergic inflammation following nasal allergen provocation in patients with allergic rhinitis and astma[J]. Allergy,2005,60(10):1301-1307.

(收稿：2016-09-14 修回：2016-10-18)

Effects of desloratadine citrate disodium on the Th1/Th2 in mice ACD model

WANGYu,LIUJing,XUEYadong,TIANJing.

TheFirstAffiliatedHospitalofHaerbinMedicalUniversity,Haerbin150001,China

TIANJing,E-mail: 953273917@qq.com

Objective: To determine the effects of desloratadine citrate disodium on the edema degree of ears and the cytokine expression of Th1/Th2 cell in murine allergic contact dermatitis (ACD). Methods: The animal model of allergic contact dermatitis was established and then the inhibition effect of desloratadine citrate disodium in different doses (1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg and 4 mg/kg) on edema degree of ACD was assessed and the expression levels of IFN-γ, TNF-α and IL-4 were detected by ELISA. Results: Desloratadine citrate disodium can reduce the edema degree of ears. The levels of IFN-γ, TNF-α and IL-4 in serum of ACD mice were higher than that in blank controls (P<0.01) and the levels of the three cytokines in serum were all decreased after interfered by desloratadine citrate disodium, with a dose-dependent. Conclusion: Desloratadine citrate disodium is effective in the treatment of allergic contact dermatitis, which may be through regulating the levels of IFN- γ, TNF- α and IL- 4.

desloratadine citrate disodium; ACD; IFN-γ; TNF-α; IL-4

哈尔滨医科大学附属第一医院，哈尔滨,150001

田静，E-mail: 953273917@qq.com