Raptor、Rictor和磷酸化Akt在日光性角化病、Bowen病及鳞状细胞癌中的表达

周 萌 刘保国 顾 静 苗国英 李小静 刘 青



·论著·

Raptor、Rictor和磷酸化Akt在日光性角化病、Bowen病及鳞状细胞癌中的表达

周 萌1刘保国2顾 静1苗国英2李小静2刘 青2

目的： 检测Raptor、Rictor和磷酸化Akt(p-Akt)在日光性角化病、Bowen病和鳞状细胞癌中的表达。方法： 采用免疫组化法检测Raptor、Rictor及p-Akt(Ser473)在20例正常皮肤、20例日光性角化病、20例Bowen病及40例鳞状细胞癌中的表达。结果： Raptor在鳞状细胞癌、Bowen病和日光性角化病中的阳性表达率分别为87.50%、70.00%和60.00%，均高于正常皮肤的25.00%(均P<0.05)；其中低分化鳞状细胞癌中Raptor的阳性表达率为100%，高于高分化鳞状细胞癌的阳性表达率75%(P<0.05)。Rictor在鳞状细胞癌、Bowen病和日光性角化病中的阳性表达率分别为80.00%、70.00%及55.00%，均高于正常皮肤阳性表达率的20%(均P<0.05)；p-Akt(Ser473)在鳞状细胞癌、Bowen病和日光性角化病中的阳性表达率分别为77.50%、65.00%及50.00%，而正常皮肤阳性表达率为0。鳞状细胞癌、Bowen病和日光性角化病中Rictor的阳性表达水平和p-Akt(Ser473)的阳性表达水平均呈正相关(均P<0.05)。结论： Raptor、Rictor和p-Akt(Ser473)的高表达可能与日光性角化病、Bowen病和鳞状细胞癌的发生发展有关。

鳞状细胞癌； Bowen病； 日光性角化病； Raptor； Rictor

哺乳动物雷帕霉素蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在感受营养信号、调节细胞生长与增殖中起着重要作用，其异常活化与人类多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。生物体内mTOR主要有mTORC1、mTORC2两种复合体，雷帕霉素靶蛋白调节相关蛋白(regulatory-associated protein of mammalian target of rapamycin, Raptor)、雷帕霉素不敏感的伴侣蛋白(rapamycin insensitive companion of mTOR, Rictor)分别为mTORC1、mTORC2的关键蛋白，磷酸化Akt的丝氨酸473(Ser473)位点p-Akt(Ser473)可反映mTORC2的活化状态。本研究旨在通过检测日光性角化(Actinic Keratosis，AK)、Bowen病(Bowen's disease，BD)、鳞状细胞癌(Squamous cell carcinoma，SCC)中Raptor、Rictor、p-Akt(Ser473)的水平，初步探讨其在AK、BD、SCC发生发展中的作用与意义，为临床早期诊断和治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集2009年1月至2015年12月河北工程大学附属医院皮肤病理室临床资料完整的患者的石蜡组织标本，AK 20例，男9例，女11例，年龄51～75岁，平均(66.61±7.34)岁；BD 20例，男13例，女7例，年龄51～70岁，平均(61.05±6.71)岁；SCC 40例，男22例，女18例，年龄49～75岁，平均(65.06±7.32)岁,其中高分化(I～II级)20例,低分化(III～IV级)20例。患者皮损部位均为头面部，无其他皮肤病或系统性疾病,术前未经激光、光动力等特殊治疗。所有标本均经两位资深病理医生复查并明确诊断，重复病理检查的病例仅入选首次资料。另选取河北工程大学附属医院整形外科手术切除的20例面部正常皮肤作为对照组，男10例，女10例，年龄25～56岁，平均(37.20±9.34)岁。SCC分级[1]：I级：未分化细胞数<25%，癌组织向真皮侵犯，不超过汗腺水平；II级：未分化细胞数25%～50%，癌组织到达真皮层；III级：未分化细胞数50%～75%，角化不明显，胞核不典型；IV级：未分化细胞数>75%，癌细胞几乎全为非典型鳞状细胞。

1.2 主要试剂 兔抗人Raptor多克隆抗体(英国Abcam公司)工作浓度为1∶50；兔抗人Rictor单克隆抗体(英国Abcam公司)工作浓度为1∶500；兔抗人p-Akt(Ser473)单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology 公司)工作浓度为1∶50；PV-9001试剂盒、DAB酶底物试剂盒及PBS购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法 石蜡标本4 μm连续切片，采用免疫组化聚合物酶标二抗法，行pH 6.0柠檬酸盐缓冲液92℃水浴15分钟修复抗原，具体步骤参照试剂盒说明书进行，DAB显色，苏木精复染。正常皮肤作为对照，PBS代替一抗作为空白对照。实验分组：正常皮肤组、AK组、BD组、SCC组。

1.4 结果判定标准 光镜下观察染色阳性物质为黄色、棕黄色或者棕褐色颗粒状物质。计数方法:每张切片均随机选取10个高倍镜视野(×400),计算出阳性细胞的平均百分率(阳性细胞数/全视野细胞数)作为每例标本阳性表达率的判定依据。结果判定采用二级计分法,按阳性细胞的百分比分级:<25%为0分,25%～50%为1分,51%～75%为2分,>75%为3分；按染色强度分级:无色为0分,浅黄色为1分,黄色或黄褐色为2分,棕褐色或褐色为3分。两级计分相加计算总得分,可分为四个等级:0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+),4～5分为中度阳性(++),6分为强阳性(+++),计算阳性表达率时,总得分≥2判定为阳性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，阳性率之间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法。Spearman秩相关分析比较Rictor和p-Akt(Ser473)之间的相关性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Raptor在SCC、BD、AK和正常皮肤中的表达 Raptor在细胞中的阳性表达主要为胞质染色。35例(87.50%)SCC中Raptor呈阳性表达，且染色强度多为中度阳性或强阳性(图1a)；14例(70.00%)BD为阳性表达，多为弱阳性及中度阳性(图1b)；12例(60.00%)AK为阳性表达，多呈弱阳性(图1c)，正常皮肤中仅5例(25.00%)阳性表达，呈弱阳性(图1d)。SCC中Raptor阳性表达率高于AK、正常皮肤(Fisher确切概率法P<0.05；χ2=23.438，P<0.05)；BD、AK中Raptor阳性表达率均高于正常皮肤，差异均有统计学意义(χ12=8.120，P<0.05；χ22=5.013，P<0.05)；低分化SCC高于高分化SCC，差异有统计学意义(Fisher确切概率法P<0.05)；SCC与BD、BD与AK相比，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 Raptor在日光性角化、Bowen病、鳞状细胞癌和正常皮肤中的表达 例

注:a与正常皮肤比较，P<0.05;b与日光性角化比较，P<0.05;c与高分化鳞状细胞癌比较，P<0.05

2.2 Rictor在SCC、BD、AK和正常皮肤中的表达 Rictor在细胞中的阳性表达主要为胞质染色。32例(80.00%)SCC中Rictor呈阳性表达，其中癌巢中央阳性表达较少，边缘表达较多(图2a)；14例(70.00%)BD为阳性表达，多呈中度阳性或弱阳性(图2b)；11例(55.00%)AK为阳性表达，多呈中度阳性表达(图2c)；正常皮肤中仅4例(20.00%)呈弱阳性表达(图2d)。SCC中Rictor阳性表达率高于AK、正常皮肤，差异均有统计学意义(χ12=4.104,P<0.05;χ22=20.000,P<0.05);BD、AK中Rictor阳性表达率均高于正常皮肤，差异均有统计学意义(χ12=10.101,P<0.05;χ22=5.227,P<0.05)；低分化SCC与高分化SCC、SCC与BD、BD与AK相比，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 Rictor在日光性角化、Bowen病、鳞状细胞癌和正常皮肤中的表达 例

注:a与正常皮肤相比，P<0.05;b与日光性角化相比，P<0.05

2.3 p-Akt(Ser473)在SCC、BD、AK和正常皮肤中的表达 p-Akt(Ser473)在细胞中的阳性表达主要为胞质染色。31例(77.50%)SCC中p-Akt(Ser473)呈阳性表达(图3a)；13例(65.00%)BD为阳性表达(图3b)；10例AK(50.00%)为阳性表达，呈中度阳性或弱阳性表达(图3c)；正常皮肤中无阳性表达，仅在基底层呈极低的局灶性弱表达(图3d)。SCC中p-Akt(Ser473)阳性表达率高于AK、正常皮肤，差异均有统计学意义(χ12=4.660,P<0.05；χ22=32.069,P<0.05)；BD、AK中p-Akt(Ser473)的阳性表达率均高于正常皮肤(χ12=19.259,P<0.05;χ22=13.333,P<0.05)；p-Akt(Ser473)在低分化SCC与高分化SCC、SCC与BD、BD与AK相比，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

表3 p-Akt(Ser473)在日光性角化、Bowen病、鳞状细胞癌和正常皮肤中的表达 例

注:a与正常皮肤相比，P<0.05;b与日光性角化相比，P<0.05

2.4 Rictor与p-Akt的相关性分析 经Spearman相关分析表明，AK、BD、SCC中Rictor的阳性表达水平和p-Akt(Ser473)的阳性表达水平均呈正相关(r=0.503,P<0.05;r=0.663,P<0.05;r=0.629,P<0.05)。

图1 Raptor的表达(免疫组化，×200):1a鳞状细胞癌；1b Bowen病；1c日光性角化；1d正常皮肤 图2 Rictor的表达(免疫组化，×200):2a鳞状细胞癌；2b Bowen病；2c日光性角化；2d正常皮肤 图3 p-Akt(Ser473)的表达(免疫组化，×200):3a鳞状细胞癌；3b Bowen病；3c日光性角化；3d正常皮肤

3 讨论

SCC系起源于表皮或附属器角质形成细胞的一种恶性肿瘤,发病率在皮肤恶性肿瘤中位居第二，具有侵袭性较高，对组织破坏性较大等特点[1]。BD是一种表皮内鳞状细胞癌，又称原位鳞状细胞癌，约3%～5%，也有认为高达20%～30%患者可演变为侵袭癌[1]。AK是长期日光暴露所引起的一种癌前期病变，约0.01%～0.3%可转变为SCC[1]。

mTOR被认为参与了多种恶性肿瘤的发生发展,并且可能成为抗癌药物发展的重要靶点[2]。其复合体mTORC1、mTORC2的组织结构不同，功能也有所差别。mTORC1可被雷帕霉素所抑制，其主要通过磷酸化下游靶蛋白S6激酶1(70 kDa ribosomal protein S6 kinase，S6K1/p70S6K)及真核启动因子4E结合蛋白1(eukaryotic initiation factor-4E-binding protein 1，4EBP1)来调节下游蛋白质翻译。mTORC1对蛋白质合成的影响被认为与恶性肿瘤发生、发展相关，其能够感受生长因子、能量状态、氨基酸等细胞内外的多种因素，从而调控细胞合成和分解代谢过程,它的异常激活将促进一系列与细胞生长、增殖和分化相关蛋白的合成增加,导致肿瘤的发生[3,4]。除此之外，mTORC1介导的脂质合成和自噬也可能参与了肿瘤形成[3]。本研究结果显示Raptor在正常皮肤细胞质中少量表达，在AK、BD中表达逐渐增强，在SCC中，尤其是低分化SCC细胞质中则高表达，提示Raptor不仅在AK、BD、SCC中存在异常活化,同时也可能与肿瘤的恶性程度及分化程度相关，此结果与张洪旺等[5]在胶质瘤中的研究一致。这为mTORC1在AK、BD、SCC中的活化提供了新的证据。

mTOR另一复合体mTORC2则通过作用于Akt，PKCα和SGK1等来调控多项生命活动，如胚胎发育、细胞骨架重建、细胞迁移、蛋白质翻译和修饰等[3,6]。Guertin[7]研究发现在PTEN缺陷的小鼠中,Rictor是前列腺癌细胞和实体瘤生长所必须的。mTORC2可能参与了肿瘤细胞运动和转移，其影响胶质瘤细胞的增殖及侵袭潜能[8]。通过沉默Rictor的表达降低mTORC2的活性能够有效抑制卵巢癌细胞、乳腺癌细胞的转移[9,10]。Carr[11]等认为， Rictor对正常表皮增殖并不是必须的，但其与皮肤肿瘤的生成与发展密切相关，抑制Rictor可延缓皮肤肿瘤的发展。本文研究显示Rictor在AK、BD、SCC中的表达均高于正常皮肤，说明Rictor的表达上调参与了AK、BD、SCC的发生发展，其在SCC癌巢边缘的表达强于中央部位，由于癌巢周边的肿瘤细胞容易侵袭和转移，提示Rictor可能参与SCC的侵袭和转移过程。Akt是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，当其苏氨酸-473位点被磷酸化时可被部分激活。p-Akt(Ser473)可反映mTORC2活化状态，其可通过灭活多种凋亡效应分子、调控细胞周期、激活端粒酶活性、促进血管生成和迁移相关程序等途径而促进肿瘤的生长和侵袭[12]。本文结果显示p-Akt(Ser473)在SCC、BD、AK中的表达水平均高于正常皮肤，SCC中表达水平又高于AK，这与连昕等[13]报道相符。p-Akt(Ser473)的不同程度表达水平与Rictor的表达水平呈正相关，表明在AK、BD、SCC中mTORC2参与了Akt的Ser473位点活化。

以上结果表明，Raptor、Rictor和p-Akt(Ser473)共同参与了AK、BD、SCC的发生和发展，所起的作用可能不同，其具体机制值得进一步的研究。国内学者发现作为mTORC1特异性抑制剂雷帕霉素可以抑制皮肤鳞癌细胞A431、Colo-16的增殖[14,15]，使细胞增殖停止在G1期，发挥抗肿瘤作用。本实验采用免疫组化方法证实了Raptor在SCC中高表达，进一步表明雷帕霉素可能有治疗SCC的作用。实验结果同时显示Rictor、p-Akt(Ser473)在SCC中呈高表达状态，且两者具有正相关性，提示抑制mTORC2可能对SCC也有一定的杀伤作用，由于mTORC2结构的复杂性，单独mTORC2抑制剂的发现还存在一定的困难性[16]，但mTORC1/2共同的抑制剂目前已应用于乳腺癌、白血病的体外试验中[10,17]，且较雷帕霉素显示出更强的杀伤肿瘤细胞作用，其在SCC中是否也有类似治疗效果还有待更一步的实验研究。

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(收稿：2016-10-07 修回：2016-10-10)

Expression of Raptor, Rictor and p-Akt in actinic keratosis, Bowen's disease and squamous cell carcinoma

ZHOUMeng1,LIUBaoguo2,GUJing1,MIAOGuoying2,LIXiaojing2,LIUQing2.

1.PostgraduateSchool,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China; 2.DepartmentofDermatology,theHospitalAffiliatedtoHebeiEngineeringUniversity,Handan056002,China

LIUBaoguo,E-mail:lbg66@163.com

Objective:To detect the expression of Raptor, Rictor and p-Akt in the lesions of actinic keratosis (AK), Bowen's disease (BD) and squamous cell carcinoma (SCC). Methods: Immunohistochemistry was used to detect the expression of Raptor, Rictor, p-Akt (Ser473) in the tissue samples from the patients with AK, BD, SCC and normal human skin. Results: The positivity rates of Raptor in SCC, BD and AK were 87.50%, 70.00% and 60.00%, which was significantly higher than that in normal skin (Ps<0.05). The positivity rate was 100% in poorly differentiated squamous cell carcinoma and 75% in well differentiated squamous cell carcinomas, with a significant difference (P<0.05). The positivity rates of Rictor in SCC, BD and AK were 80.00%, 70.00% and 55.00%, which was significantly higher than that in normal skin (P<0.05). The positivity rates of p-Akt (Ser473) in SCC, BD and AK were 77.50%, 65.00% and 50.00%, while there was no positive staining in normal skin. There was a positive correlation between the expression level of Rictor and p-Akt (Ser473) in SCC, BD and AK (P<0.05). Conclusion: The high expression of Raptor, Rictor and p-Akt (Ser473) may play a key role in the occurrence and development of AK, BD and SCC.

Squamous cell carcinoma; Bowen's disease; actinic keratosis; Raptor; Rictor

河北省政府资助临床优秀人才培训项目(编号：361037) 邯郸市科技技术研究项目(编号：1523108076)

1承德医学院研究生院，河北承德,067000 2河北工程大学附属医院皮肤科，河北邯郸,056002

刘保国，E-mail：lbg66@163.com