Th22细胞及其细胞因子在斑秃患者外周血中的表达

邬松涛 周 英 何 平 黄 丽 黄贵义



·论著·

Th22细胞及其细胞因子在斑秃患者外周血中的表达

邬松涛1周 英2何 平3黄 丽1黄贵义4

目的： 检测Th22及其细胞因子在斑秃患者外周血中的表达。方法： 采用流式细胞仪检测38例斑秃患者及38例对照的Th22细胞水平，用酶联免疫吸附检测细胞因子IL-22、IL-17的水平。结果： 斑秃患者外周血Th22、Th17、IL-17+IL-22+CD4+、IFN-γ+IL-22+CD4+T及血清IL-22、IL-17水平均高于正常对照组(P<0.05)；重型斑秃和活动期患者高于轻型斑秃患者和稳定期患者的表达(均P<0.05)。结论： Th22及其细胞因子在斑秃患者中表达升高。

斑秃； Th22； IL-22； IL-17

斑秃(alopecia areata，AA)属于常见累及毛发的非瘢痕性、突发性及慢性炎症疾病，任何年龄均可发病，但年轻人属于多发群体。已有学者通过研究发现：斑秃容易复发，其发病可能与免疫功能异常、内分泌障碍、神经精神、遗传等因素相关[1]。斑秃不仅加重了家庭负担，而且还降低了患者自信心，尤其是青年男女。有学者通过动物实验研究显示[2]：斑秃的发病机制可能与皮损处毛囊周围T细胞相关。为此，本文为了进一步探讨Th22及其细胞因子在斑秃患者外周血中的表达及意义，特选取斑秃患者与健康体检者进行对比研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 38例斑秃患者来自于我院2015年1月至2016年5月收治患者，所有患者均符合《中国临床皮肤病学》斑秃诊断标准，入选前2个月内未接受全身糖皮质激素、免疫抑制剂等药物治疗，患者均知情同意，并经过我所伦理委员会的批准。无假性秃发、先天性秃发、孕妇、严重心肾功能疾病、精神病者。38例患者中男20例，女18例，年龄18～56岁，平均(36.12±6.12)岁；重型斑秃为脱发面积达头皮30%以上，重型斑秃12例， 12例全秃者表现为头发全部脱落，12例全秃者有3例患者为普秃患者(除了全秃外，还表现为一定的胡须、眉毛、腋毛的普遍脱落)。26例局限性斑秃者表现为斑片状脱发，可单发或多发。根据拔发试验确定观察组患者是否处于活动期，本观察组患者中活动期组22例，患者皮损表现为拔发试验阳性，稳定期组16例，患者皮损表现为拔发试验阴性，1个月内未出现新的秃发区。同时选取同期我院进行体检的健康者38名，通过查体及实验室检查各项指标均正常。其中男25名，女13名，年龄19～55岁，平均(37.21±6.05)岁。两组在性别、年龄上无显著差异(P>0.05)，具有可比性。

1.2 仪器与试剂 流式细胞仪由苏州陶迈森科学仪器有限公司生产；离心机、微量加样器由上海曙诚医疗科技发展有限公司生产；青岛海尔提供的-20℃冰箱、4℃冰箱、生物安全柜；山东新华医疗器械有限公司提供高压灭菌器、10 mL肝素钠抗凝管、吸头、离心管等；上海博华生物科技有限公司提供的人 IL-22 ELISA 试剂盒、人 IL-17 ELISA试剂盒；中国科学院生物工程研究所提供的淋巴细胞分离液；由天津市华东试剂厂提供的多聚甲醛等。

1.3 检测方法

1.3.1 外周血单个核细胞培养 取新鲜肝素钠抗凝外周血，离心去除血浆；充分混匀；吸取4 mL淋巴细胞分离液置于10 mL离心管内；沿着离心管侧壁缓慢注入全血，最大限度不让血液进入淋巴细胞分离液中；1700 r/min离心30 min，取出中间白膜层，将其转移到新的离心管内；加入PBS充分混匀，1800 r/min离心15 min洗涤后，加入培养液，混匀；吸取200 μL的细胞混悬液，装入孵育板中，置于恒温箱孵育4 h。

1.3.2 Th22的流式细胞仪检测 4 h后取出孵育板，吸取细胞混悬液，装入流式管内；加入PBS吹打混匀，1200 r/min，离心5 min洗涤1遍；去除上清，加入B 50 μL破膜剂，加入1 μL IL-22、IL-17的荧光标记抗体，待混匀后，置于4℃冰箱内保存；24 h后，采用美国BD公司生产的FACS Calibur 型流式细胞仪对其检测，采用软件Flowjo(v7.6.2)对检测数据加以分析。

1.3.3 细胞因子的酶联免疫吸附检测 取足够量的酶标包板，固定于框架上，设置三孔，即标准品孔(50 μL标准品)、待测样本孔(加40 μL稀释液+10 μL待测样本)、空白对照孔(不加任何物质)；置于37℃恒温箱保存30 min；取出酶标包板，采用吸水纸将其拍干，每一孔内加入稀释后的洗涤液，1 min后，甩去洗涤液；除了空白对照孔外，其余两孔加入50 μL酶标工作液；置于37℃恒温箱保存30 min；再洗板；每一孔内加入50 μL显色剂A液、50 μL显色剂B液，均匀混合，置于37℃恒温箱15 min；取出酶标包板，每一孔内加入50 μL终止液，15 min内，采用450 nm 波长对每一孔内的吸光值加以测量。

1.4 观察指标 观察并记录两组Th22及其各细胞因子的表达水平。测定圆形脱发患者的直径，测定椭圆形脱发患者的长轴和短轴，计算脱发面积。

2 结果

2.1 Th22+CD4+T细胞表达水平标记 见表1。观察组与对照组在Th22、Th17的表达频率上均有显著差异(P<0.0001)；观察组与对照组在IL-17+IL-22+CD4+、IFN-γ+IL-22+CD4+T的表达上均有显著差异(P<0.0001)。与轻型斑秃患者和稳定期患者相比，重型斑秃和活动期患者Th22、Th17、IL-17+IL-22+CD4+、IFN-γ+IL-22+CD4+T的表达进一步升高(P<0.0001)。

表1 Th22+CD4+T细胞表达水平标记 %

注：*与对照组相比，P<0.05；#与轻型斑秃相比，P<0.05；&与稳定期患者相比，P<0.05

2.2 血清IL-22、IL-17的表达水平 见表2。观察组患者血清中IL-22水平高于对照组，经统计分析，有显著性差异(P<0.0001)；观察组患者血清中IL-17水平高于对照组，经统计分析，有显著性差异(P<0.0001)，与轻型斑秃患者和稳定期患者相比，重型斑秃和活动期患者血清中IL-22和IL-17水平进一步升高(P<0.0001)。

表2 血清IL-22、IL-17、IFN-γ的表达水平比较

注：*与对照组相比，P<0.05；#与轻型斑秃相比，P<0.05；&与稳定期患者相比，P<0.05

2.3 血清IL-22、IL-17、Th22+CD4+T细胞百分比与脱发面积的相关性 经一元线性回归分析可知，观察组外周血中Th22、Th17、IL-17+IL-22+CD4+、IFN-γ+IL-22+CD4+T以及血清中IL-22和IL-17水平与脱发面积呈正相关(P<0.05)。

3 讨论

Th22细胞最先于2000年由Renauld发现，是最新发现的新型辅助性T细胞亚群，其效应与其他CD4+效应T细胞亚群相似[3]。Th22细胞不仅可诱导其他细胞的分化，而且还参与T细胞亚群的极化过程，调节自身免疫性疾病的免疫应答，参与皮肤病理状态的发展。已有学者通过研究表明[4]：Th22细胞参与了多种自身免疫性疾病的发生及发展，如：风湿性关节炎、红斑狼疮等疾病。一般情况下，Th22细胞与其他的细胞群可相互调控，进而使得机体处于平衡状态。若机体处于疾病状态下，Th22细胞则可产生其他的细胞因子，如：IL-13、IL-22、IL-26等，其中细胞因子IL-22是最主要的细胞功能因子，该细胞因子独立于Th1、Th2、Th17细胞亚群[5]。由于IL-22细胞功能因子包括IL-22R1链、IL-22R2链，其中IL-22R1链有着重要作用，对IL-22细胞的特异性有一定影响，而IL-22R2链则主要起到信号传导的作用。人的皮肤、肺、肾内都存在IL-22R1链，但人体内各个组织都存在IL-22R2链[6]。因此，IL-22可调节特定组织细胞，尤其是上皮细胞功能，如：肝细胞、腺泡细胞、结肠上皮下肌成纤维细胞等，加以诱导进而生成趋化因子、炎症因子及S100家族蛋白等[7,8]。

另有学者通过研究表明[9]：Th22细胞在皮肤应变性疾病的发展中有着重要作用，如：银屑病、红斑狼疮等，以上疾病患者中Th22细胞水平均高于健康者，且参与疾病的发展过程，影响疾病严重程度。国外学者[10]对斑秃患者的外周血CD4+CD25+Treg细胞、TGF-β1的研究较多，且取得显著成效，但对Th22与IL-22水平在斑秃患者中的表达研究几乎没有。为此，本研究通过选取38例斑秃患者与38名健康体检者进行对比研究，得到斑秃患者的Th22水平高于健康体检者，且IL-22、IL-17水平也高于健康体检者，与轻型斑秃患者和稳定期患者相比，重型斑秃和活动期患者Th22、Th17、IL-17+IL-22+CD4+、IFN-γ+IL-22+CD4+T的表达血清中IL-22和IL-17水平进一步升高，且观察组外周血中Th22、Th17、IL-17+IL-22+CD4+、IFN-γ+IL-22+CD4+T以及血清中IL-22和IL-17水平与脱发面积呈正相关，提示外周血中Th22及其细胞因子可能参与斑秃的发生、发展及预后。

综上所述，斑秃患者外周血中Th22及其细胞因子的水平高于健康者，可作为治疗及预后评价的参考依据。

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(收稿：2016-09-19 修回：2016-10-11)

Peripheral blood levels of Th22 and its associated cytokines in the patients with alopecia areata

WUSongtao1,ZHOUYing2,HEPing3,HUANGLi1,HUANGGuiyi4.

1.ChangdeInstituteofDermatologyandVenereology,Changde415000,Hunan,China;2.DepartmentofDermatovenerology,theSecondXiangyaHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha410000,China;3.DepartmentofDermatovenerology,theFirstPeople'sHospitalofChangde,Changde415000,Hunan,China;4.NanfengCountyInstituteofDermatologyandVenereology,Nanfeng344500,Jiangxi,China

HUANGGuiyi,E-mail:hxfu6688@126.com

Objective: To detect the Th22 and its associated cytokines in the patients with alopecia areata. Methods: The levels of Th22 and associated cytokines (IL-22 and IL-17) in 38 patients with alopecia areata and 38 healthy controls were detected by flow cytometry and ELISA. Results: The expression levels of Th22, Th17, IL-17+IL-22+, CD4+, IFN-gamma+IL-22+CD4+T, IL-22 and IL-17 in the parents were higher than those in controls (P<0.05) and all the cytokines mentioned above in the patients with severe alopecia areata were higher than those in the patients with mild alopecia areata (P<0.05). Conclusion: The levels of Th22 and cytokines in the patients with alopecia areata are increased.

alopecia areata; Th22; IL-22; IL-17

1常德市皮肤病性病防治所,湖南常德,415000 2中南大学湘雅二医院皮肤性病科,湖南长沙,410000 3常德市第一人民医院皮肤性病科,湖南常德,415000 4南丰县皮肤病性病防治院,江西南丰,344500

黄贵义， E-mail: hxfu6688@126.com