百里香酚-壳聚糖复合膜及其在猪肉保鲜中的应用

王 娣WANG Di 张仁凤 - 张 彬 程 柏 许 晖 柯春林 - 任茂生 -

(蚌埠学院生物与食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

百里香酚(Thymol)又称麝香草酚[1]，是百里香属植物中重要成分，主要存在于百里香精油和百里香活性提取物中。国内外研究发现百里香酚对常见食品污染菌如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等均有一定抑制作用[1-4]，对鲜切蔬菜、水果等保鲜也有影响，保鲜效果较好[5-7]，但未发现用于肉类的保鲜中。单核增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)是常见的肉类食品污染菌，致病性很强，可导致人死亡。调查发现中国多个省份都有关于人和动物感染单核增生李斯特氏菌的案例报道[8]，尤其猪肉、牛肉等生鲜食品容易感染李斯特氏菌[9-11]，目前尚未见到有关百里香酚对食品污染菌单核增生李斯特氏菌的研究报道。

本试验采用管碟法研究百里香酚对单核增生李斯特氏菌的最小抑制浓度，并研究不同浓度的百里香酚对单核增生李斯特氏菌生长曲线及细胞渗透性的影响；制作百里香酚-壳聚糖复合膜(CH/TO)，并把复合膜应用于猪肉的保鲜中，研究复合膜对猪肉保藏中菌数的影响，为百里香酚作为一种新型肉类保鲜剂的开发与应用提供一定参考。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料、菌种与试剂

猪后腿瘦肉：购自蚌埠家乐福超市；

单核增生李斯特氏菌(Listeriamomocytogenes)：CGMCC1.9144，中国科学院微生物研究所；

胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基(TSA-YE)：上海博微生物科技有限公司；

胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤培养基(TSB-YE)：上海博微生物科技有限公司；

吐温-80、冰醋酸、丙三醇、葡萄糖：分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；

DPPH：分析纯,东京化成工业株式会社；

百里香酚：AR级，国药集团化学试剂有限公司；

壳聚糖：脱乙酰度95%，BR级，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器

恒温培养箱：PWT-P42B型，华德利科学器材有限公司；

恒温振荡箱：HZQ-X500型，上海一恒科学仪器有限公司；

牛津杯：10 mm×7.8 mm×6 mm，中国科欢有限公司；

高速冷冻离心机：KDC-160HR型，安徽中科中佳科学仪器有限公司；

微生物比浊仪：WBS-100型，北京先驱威锋技术开发公司；

紫外可见分光光度计：TU-1901型，北京普析通用仪器有限责任公司；

电导率仪：DDBJ-350型，齐威仪器有限公司；

质构仪：TA.XT Plus型，英国Stable Micro Systems公司。

1.2 试验方法

1.2.1 百里香酚抑菌活性研究

(1) 不同浓度百里香酚溶液的配置：取1.00 g百里香酚，加入0.5%吐温-80，用无菌水溶解，配置成浓度为1.00 mg/mL 的原液密封冷藏，备用。

(2) 最小抑菌浓度(MIC)的测定：采用管碟法检测百里香酚对单核增生李斯特氏菌的最小抑菌浓度(MIC)[12][13]24,53。制作含单核增生李斯特氏菌的TSA-YE平板，将无菌牛津杯置于平皿内，注入不同浓度(100.00，50.00，25.00，12.50，6.25 μg/mL)的百里香酚溶液100 μL，做空白对照。

(3) 百里香酚对单核增生李斯特氏菌生长曲线的影响：研究1/2 MIC、1 MIC百里香酚不同浓度对李斯特氏菌生长曲线的影响[14]。在比色管中加入TSB-YE培养基10 mL，使比色管里的菌体浓度在1×106CFU/mL，百里香酚终浓度为1/2 MIC、1 MIC，做空白对照；生长曲线检测采用微生物比浊仪，每隔1 h测吸光度值A600 nm。

(4) 细胞膜渗透性及细胞中核酸、蛋白质泄露的检测：利用电导率法研究百里香酚对细菌细胞膜的影响[13]52。电导率是衡量溶液离子强度高低的参数，抑菌剂会破坏微生物细胞膜，使细胞渗透性增强，电解质外泄，电导率上升[14]。在260，280 nm处测吸光度值分析细胞中核酸和蛋白质的泄露[15]。参照并改进Kong等[16]的方法，将单核增生李斯特氏菌悬液用5%葡萄糖溶液清洗获得等渗细胞；移取106CFU/mL 菌悬液至无菌比色管中，加入百里香酚使其终浓度为0，1，2 MIC，每隔0.5 h测1次电导率；测细菌核酸(A260)和蛋白质(A280)的泄露量。

1.2.2 百里香酚-壳聚糖复合膜(CH/TO)的制作及其性能检测

(1) CH/TO复合膜的制作：壳聚糖是天然多糖中唯一的阳离子聚合多糖，具有一定抗氧化和抑菌活性[17-18]。将百里香酚和壳聚糖混合制备复合膜，使其在百里香酚膜中含量为0.00%，0.25%，0.50%，1.00%。具体方法：取2.0 g壳聚糖，加入不同量百里香酚(0.25，0.50，1.00 g)，再加入1.0 mL 冰醋酸、1.0 mL丙三醇和200 μL吐温-80，去离子水定容至100 mL，搅拌混匀后超声脱气，40 ℃ 烘干成膜，4 ℃ 冷藏，备用。

(2) CH/TO复合膜的硬度与强度检测：采用质构仪检测百里香酚-壳聚糖复合膜(CH/TO)硬度和穿刺强度。比较不同浓度(0.25%，0.50%，1.00%)百里香酚-壳聚糖复合膜的硬度；选择直径2 mm的探针，比较不同浓度百里香酚-壳聚糖复合膜的穿刺力，做空白对照。

(3) CH/TO复合膜对DPPH自由基清除活性：抗氧化试验参考文献[19]，比较在15，25 ℃时 CH/TO的抗氧化能力。将CH/TO样品(3 cm×3 cm)置于50%的乙醇溶液中，每隔1 h取1 mL与4 mL DPPH溶液混匀，避光静止30 min，于517 nm处测吸光度。DPPH自由基清除能力按式(1)计算：

(1)

式中：

P——DPPH自由基清除率，%；

A0——空白的吸光度值；

Ai——样品的吸光度值。

1.2.3 CH/TO复合膜对猪肉的保鲜作用

(1) 猪肉保藏中菌落总数的测定：将猪后腿瘦肉无菌分割成5.0 g肉块，用壳聚糖膜和百里香酚浓度为1%的CH/TO复合膜包裹，4 ℃冷藏，每隔2 d测定菌落总数[20]。

(2) 猪肉感官评定：感官评定小组由6人组成，每隔2 d对猪肉的颜色、气味、百里香味进行综合评定[21]。按表1采用5点评分法对猪肉进行评分。

2 结果与分析

2.1 抑菌作用研究

表2百里香酚对单核增生李斯特氏菌抑菌圈大小†

Table 2 Inhibitory effect of thymol on the size of inhibitory zone ofListeriamonocytogenes

† “--”表示没有抑菌圈；不同小写字母表示同一列数据之间有显著性差异(P<0.05)。

2.1.1 最小抑菌浓度(MIC) 由表2和图1可知，随着百里香酚浓度的增加，对单核增生李斯特氏菌的抑菌圈直径不断增加，当百里香酚浓度为6.25 μg/mL时，无抑菌圈且牛津杯内有少许菌生长。因此确定最小抑菌浓度(MIC)为12.5 μg/mL。

2.1.2 对单核增生李斯特氏菌生长曲线的抑制作用 由图2 可知，空白对照组中单核增生李斯特氏菌生长正常；而百里香酚浓度为1 MIC时，细菌几乎不生长；在1/2 MIC浓度下，细菌迟滞期比较长，且菌体生长缓慢，菌数远低于空白对照组。

2.1.3 细胞膜渗透性 电导率的改变直接反映出细胞渗透性的变化。由图3可知，空白对照组电导率变化幅度很小。随着百里香酚浓度的增加(1 MIC和2 MIC)和时间的延长，电导率值不断增加，表明有离子释放出来，可能是一定浓度的百里香酚破坏了单核增生李斯特氏菌的细胞膜渗透性，随着细胞膜的破坏，细胞内组分泄漏所致。

2.1.4 细胞中核酸和蛋白质泄露 百里香酚对单核增生李斯特氏菌作用后的菌悬液随时间的变化情况(A260、A280)见图4、5。试验结果表明，百里香酚能使单核增生李斯特氏菌细胞渗透性增加，使细胞内大分子物质核酸和蛋白质泄漏出来。由图4、5可知，0.0～0.5 h，吸光度值基本无变化，说明百里香酚抑菌需要作用一段时间，随着百里香酚浓度的增加和时间的延长，吸光度值开始逐渐增加，并在1.5 h后达到平衡，表明百里香酚破坏了细菌的细胞膜，细胞内的核酸和蛋白质发生泄露所致；空白对照组的吸光度则始终未发生变化，表明细胞中核酸和蛋白质的泄露与百里香酚的作用有关。

2.2 百里香酚-壳聚糖复合膜(CH/TO)的制作及其性能检测

2.2.1 CH/TO复合膜的制作 由图6可知，空白的壳聚糖膜颜色比较淡，随着百里香酚浓度的增加，混合溶液呈现乳白色，可能是吐温-80乳化作用所致，成膜后膜颜色随百里香酚浓度的增加而加深，呈淡黄色，同时散发出百里香酚的独特芳香气味。

2.2.2 CH/TO的硬度与穿刺强度 由表3可知，随着百里香酚浓度的增加，穿刺强度从106.35±2.35逐渐减小至70.6±2.3，硬度从236.7±11.1逐渐降至80.1±7.7，降幅明显，可能是百里香酚属疏水性物质，会破坏膜的均一性和连续性，使膜的韧性下降。

† 不同小写字母表示同一列数据之间有显著性差异(P<0.05)。

2.2.3 DPPH法测定百里香酚-壳聚糖复合膜抗氧化作用

由图7、8可知，百里香酚能有效清除DPPH自由基，清除率随百里香酚浓度的增加不断增大并趋于平衡；温度对DPPH自由基清除能力也有一定影响，15 ℃效果低于25 ℃，百里香酚浓度为1.00%的CH/TO， 25 ℃温度下4 h时DPPH自由基清除率超过75%，而15 ℃温度下DPPH自由基清除率不到60%。可能高温更有利于DPPH自由基的清除。

2.3 百里香酚-壳聚糖复合膜对猪肉的抑菌保鲜作用

Figure 7 DPPH removal rate of different concentration thymol of compound membrane at 25 ℃

Figure 8 DPPH removal rate of different concentration thymol of compound membrane at 15 ℃

2.3.1 菌落总数检测 在NY 5029—2008中规定，鲜猪肉的菌落总数标准为≤1×106CFU/g。由图9可知，在0～2 d 时，壳聚糖膜和CH/TO复合膜包裹的猪肉菌落总数基本相同，壳聚糖膜包装的猪肉在第8天超过了NY 5029—2008标准限值，菌落总数增加了60%，而CH/TO包装的猪肉，在12 d后菌落总数仍低于标准限值，只增长了19%，表明百里香酚-壳聚糖复合膜可以有效抑制微生物的生长，延长猪肉的贮藏期。

2.3.2 感官评定 由表4和图10可知，经过10 d的冷藏，使用保鲜膜包裹的猪肉色泽由初始值1增加到最大值5，在第10天肉色失去光泽、发绿并伴有腐败臭味。CH/TO复合膜处理后的猪肉，冷藏到10 d色度略增加，没有出现臭味。

3 结论

† 不同小写字母表示同一列数据之间有显著性差异(P<0.05)。

本试验对百里香酚的抑菌活性进行研究，结果表明其对食品污染菌单核增生李斯特氏菌具有一定抑菌作用，最小抑菌浓度为12.5 μg/mL；且百里香酚会破坏单核增生李斯特氏菌细胞膜，细胞内含物渗出引起电导率变化，使核酸和蛋白质发生泄漏；百里香酚-壳聚糖复合膜性质检测试验表明膜的硬度和穿刺强度会随着膜中百里香酚浓度的增加而逐渐降低，且复合膜具有一定抗氧化能力，对DPPH自由基清除率为75%(1.00%百里香酚，25 ℃)；为完善复合膜的性能，后续试验将添加不同浓度的乳化剂和塑化剂与百里香酚复合成膜，并用于猪肉油脂的抗氧化研究中；百里香酚-壳聚糖复合膜猪肉保鲜试验结果表明复合膜能有效地抑制猪肉中微生物的生长繁殖，降低菌落总数，延长猪肉的冷藏期，后续试验将深入研究百里香酚对猪肉腐败菌群的抑制作用，进一步提高百里香酚的实际应用价值。

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