嗜水气单胞菌脂多糖提取及毒性研究

蒋栋磊JIANG Dong-lei 刘 延 葛攀玮 - 吴满刚 - 葛庆丰 - 方维明 -

(扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127)

中国淡水养殖业发达，淡水鱼主要依靠微冻保鲜技术保存[1]，但部分耐冷菌株增殖导致鱼类腐败变质，造成严重经济损失[2]。其中嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)是主要腐败菌之一[3]。大量研究表明嗜水气单胞菌腐败能力与其毒力因子密切相关[4-5]，其中脂多糖(LPS)由多糖链与类脂组成，具有高毒性和免疫学活性[6]。

细胞是构成生物体的基本组成和功能单元[7]。细胞模型利用细胞的高敏感性，迅速识别外界环境变化，具有主动、真实、准确等优势[8]。根据细胞生理变化和细胞力学的特殊性质，可将细胞用于对危害物的检测和评价[9-10]。本试验选用的巨噬细胞Ana-1对外源物应激反应较强，具有充足的研究基础， Wang Hui等[11]和WANG Xue-mei等[12]分别利用巨噬细胞Ana-1细胞模型研究了弓形虫诱导HMGB1释放作用，以及LPS对细胞的毒性及损伤作用。

本试验提取了嗜水气单胞菌菌体表面的脂多糖(LPS)，并创新地利用巨噬细胞Ana-1模型对其毒性进行评价。菌体表面LPS进行提取纯化采用改良的热酚水法[13-14]、酶解法[15]与醇沉法[16]，并测算LPS产率，检测所得纯化LPS样品中蛋白质与核酸含量，利用SDS-PAGE电泳分析纯度。建立巨噬细胞Ana-1模型，通过细胞活力、胞内Ca2+水平变化以及电镜观察，比较纯化LPS样品与LPS标准品对巨噬细胞Ana-1的损伤情况，判定纯化LPS样品的毒性和生物活性，为后续提取与检测方法的开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

嗜水气单胞菌菌株(Aeromonashydrophilasubsp.hydrophilaATCC 7966 chromosome)： 由扬州某市场的草鱼样品分离得到；

巨噬细胞Ana-1：中科院上海细胞库；

LPS标准品、DNase I、RNase A、蛋白酶K：美国Sigma公司；

胰酶消化液、Fluo-4 AM (5 mmol/L)钙离子荧光探针、CCK-8试剂盒：碧云天生物技术有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

单人双面净化工作台：SW-CJ-1F型，苏州净化设备有限公司；

高压蒸气灭菌锅：SX-500型，日本TOMMY公司；

台式高速冷冻离心机：Sorvall ST 16R型，美国Thermo Fisher公司；

冷冻干燥机：Alpha 1-2LD PoLus型，德国Martin Christ公司；

CO2恒温培养箱：3111型，美国Thermo Fisher公司；

荧光显微镜：IX51型，日本Olympus公司；

酶标仪：Infinite 200 PRO型，瑞士Tecan公司；

核酸蛋白测定仪：BioPhotometer plus型，德国Eppendorf公司；

场发射扫描电镜：S-4800型，日本日立公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌体培养 参照文献[17]。将冻存的嗜水气单胞菌菌株置室温下解冻，划线于AHM琼脂培养基，28 ℃培养24 h，挑取单菌落接入LB培养基，28 ℃摇床培养12 h后，8 000 r/min 离心10 min，收集菌体，沉淀依次用生理盐水与无菌蒸馏水洗涤1次后，收集沉淀称重，用3倍质量无菌蒸馏水重悬(即1 g菌体加入3 mL蒸馏水)，得到菌悬液。

1.2.2 LPS粗提取 参照文献[13]。菌悬液反复冻融5次后，与等体积90%苯酚混合，68 ℃恒温水浴振荡1 h，冰浴至4 ℃，4 000 r/min冷冻离心20 min。收集上清，下层酚相加等体积无菌蒸馏水重复洗涤1次，合并2次上清于透析袋中，蒸馏水透析至FeCl3检测无酚试剂反应出现。透析所得溶液经真空冷冻干燥处理24 h，即制得 LPS粗样。

1.2.3 LPS的纯化 参照文献[14～16]的方法，并加以改良。10 mL Tris-HCl (100 mmol/L，pH 8.0)溶解LPS粗样，加终浓度20 mg/mL DNase I与10 mg/mL RNase A，37 ℃酶解2 h后，加终浓度20 mg/mL蛋白酶K，57 ℃处理1 h，趁热加入5 mL水饱和苯酚，混匀，4 000 r/min离心30 min，吸取上清于透析袋中，蒸馏水透析48 h后，溶液真空冷冻干燥24 h。冻干产物置于氯仿/甲醇(体积比2∶1)混合液中充分混匀，12 000 r/min离心20 min，弃上清并晾干沉淀。10 mL 蒸馏水溶解沉淀后真空冷冻干燥24 h，即得到纯化LPS样品，于-20 ℃保存备用。

1.2.4 LPS中物质的测定

(1) 蛋白质含量测定：5 mL蒸馏水溶解纯化LPS样品，用核酸蛋白测定仪检测样品中蛋白质含量，检测波长280 nm，读数稳定后读取结果，重复3次。

(2) 核酸含量测定：5 mL蒸馏水溶解纯化LPS样品，用核酸蛋白测定仪检测样品中核酸含量，检测波长260 nm，读数稳定后读取结果，重复3次。

1.2.5 LPS纯度分析 采用 SDS-PAGE 法，浓缩胶 3%，分离胶 10%，上样电泳后银染色，进行纯度分析。

1.2.6 LPS样品对Ana-1细胞影响检测

(1) CCK-8检测细胞活力：于1 000 r/min离心4 min，收集对数生长期细胞，用无血清培养液重悬后转移至96孔板中(约5 000个/孔)于37 ℃培养12 h。分别加入终浓度为5 μmol/L的LPS标准品与纯化LPS样品，并设置不含LPS的空白对照组，每组3个重复。37 ℃处理3 h后每孔加入培养液总体积10%(10 μL)的CCK-8，37 ℃孵育1 h，测定其在450 nm处吸光度，根据式(1)计算细胞活力。

(1)

式中：

C—— 细胞活力，%；

A1——加药组450 nm处吸光度；

A2——空白对照组450 nm处吸光度。

(2) 细胞内Ca2+水平的检测：收集对数生长期细胞，无血清培养液重悬后转移至24孔板中，37 ℃培养12 h后，用0.1 mol/L PBS洗涤细胞3次，每孔加入终浓度3 μmol/L的Fluo-4 AM探针，37 ℃培养1 h后，用0.1 mol/L PBS洗涤细胞3次，再孵育30 min以确保细胞内Fluo-4 AM转变为Fluo-4。随后分别加入终浓度为5 μg/mL的LPS标准品与纯化LPS样品，37 ℃处理3 h，每组3个平行，空白对照组不添加LPS。使用IX51荧光显微镜观察拍照，酶标仪检测荧光，检测激发波长为455 nm，发射波长为515 nm[18]。

(3) Ana-1细胞损伤的电镜观察：将Ana-1细胞经终浓度为5 μg/mL的LPS处理3 h后，收集细胞，琼脂包裹切片加入2.5%的戊二醛中固定4 h，保存于4 ℃冰箱中。然后用0.1 mol/L的PBS清洗3次，每次15 min。按照50%，70%，80%，90%，95%，100%的乙醇梯度脱水，每次15 min，然后用含无水硫酸钠的100%乙醇再脱水15 min。将样品放入CO2临界点干燥45 min，取出黏贴在样板上准备镀膜，利用S-4800型场发射扫描电镜进行观察。

2 结果与分析

2.1 LPS提取与纯化结果

1.2 L的LB培养基培养24 h，收集菌体湿重为6.22 g，提取纯化后得到LPS共76.1 mg， LPS平均产率为1.22%。测得的蛋白浓度为232.87 mg/L，核酸浓度为120.51 mg/L，计算得出纯化后LPS中蛋白质占1.53%，核酸占0.79%，提取纯度较高，为下一步LPS毒性及生物活性检测减少干扰。

2.2 LPS纯度

1. LPS标准品 2. 纯化LPS样品

由图1可知，纯化LPS样品的主要条带清晰，大部分条带位置与标准品条带位置相同，均可以判定是LPS条带，说明纯化LPS结构完整，纯度较高。然而，泳道2顶端存在杂带，说明纯化LPS样品中仍有大分子杂质残留，结合2.1结果分析，杂带可能是残留蛋白质。

2.3 LPS对Ana-1细胞活力的影响

由图2可知，当终浓度为5 μg/mL时，LPS标准品与纯化LPS样品均能够显著抑制Ana-1细胞的活力。与空白组相比，LPS标准品组细胞活力降低了24.83%，纯化LPS样品组细胞活力降低了21.20%。与纯化LPS样品比较，LPS标准品对Ana-1细胞的活力抑制效果更强，但两组间无显著性差异(P>0.05)。

不同字母表示组间具有统计学差异(P<0.05)

2.4 LPS对细胞内Ca2+水平的影响

试验所使用的Fluo-4 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，Fluo-4 AM进入细胞后被酶剪切形成Fluo-4，与胞内Ca2+结合，产生荧光[19]。

图3显示装载了Fluo-4荧光探针后，Ana-1在荧光显微镜下的图像。图3(a)为只装载探针的空白对照组，荧光强度弱；图3(b)与3(c)分别为加入LPS标准品和纯化LPS样品处理的Ana-1细胞，从图中可以看到较明显的荧光。结合数据分析，与空白对照组比较，LPS标准品组相对荧光强度为1.92±0.12，纯化LPS样品组为1.67±0.19。结果表明，经LPS处理后，Ana-1细胞胞内Ca2+水平升高，且LPS标准品的作用强于纯化LPS样品的，但不存在显著性差异(P>0.05)。

2.5 LPS对Ana-1细胞损伤的电镜观察

图3 LPS(5 μg/mL)对巨噬细胞Ana-1胞内Ca2+水平的影响

图4 LPS对Ana-1细胞形态的影响

由图4(a)可知，放大6 000倍观察正常Ana-1细胞形态饱满，表面光滑有细微绒毛状结构。图4(b)经5 μg/mL LPS标准品处理3 h后8 000倍观察，Ana-1细胞膜变得粗糙并脱落，细胞表面出现空洞，内部结构露出，形态已不完整，证明了细胞发生了较严重的破损。图4(c)为扫描电镜放大8 000 倍观察到的经5 μg/mL纯化LPS样品处理3 h后的Ana-1细胞，细胞同样表现为破损，表面有明显的空洞，细胞膜变得粗糙。说明LPS可以导致小鼠巨噬细胞Ana-1的损伤；纯化LPS样品与LPS标准品造成的损伤类似，但纯化LPS样品的毒性与生物活性相对较高。

3 结论

本试验成功制得了纯化LPS样品，杂质含量少，与LPS标准品相比，对Ana-1细胞造成损伤无显著性差异(P>0.05)。说明改良后的热酚水法及酶解法、氯仿/甲醇沉淀法能够较完好地提取、纯化菌体表面LPS，同时表明巨噬细胞Ana-1模型用于评价LPS的毒性与生物活性具有可行性，为LPS提取、检测方法的后续开发提供思路与技术支持。

与宋宏新等[15]、刘红亮等[16]的结果相比，本试验LPS产率更高，蛋白质含量更低，但纯化LPS样品中仍有0.79%的核酸残留，与宋宏新等[15]的研究结果相似。LPS能够显著抑制Ana-1细胞活力并提高胞内Ca2+浓度，同时经扫描电镜观察LPS对Ana-1细胞形态造成了一定程度的损伤，证实了Wang Xue-mei等[14]的相关研究报道结果。

为了进一步优化LPS提取、纯化方法，能否通过增加DNase I与RNase A酶浓度，延长消化时间来减少核酸残留有待深入研究。而巨噬细胞Ana-1模型的细胞活力，胞内Ca2+浓度以及细胞形态变化只能说明LPS对细胞造成损伤，具体损伤机制尚不明确，仍需进一步研究LPS对细胞脱颗粒、白介素的分泌等影响，探明损伤机制。

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