接种发酵对酸菜品质的影响

孟繁博张万萍 吴康云

(1. 贵州省现代农业发展研究所，贵州 贵阳 550006；2. 贵州大学农学院，贵州 贵阳 550025；3. 贵州省园艺研究所，贵州 贵阳 550006)

接种发酵对酸菜品质的影响

孟繁博1张万萍2吴康云3

(1. 贵州省现代农业发展研究所，贵州 贵阳 550006；2. 贵州大学农学院，贵州 贵阳 550025；3. 贵州省园艺研究所，贵州 贵阳 550006)

以青菜为原料，选用鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌3种乳酸菌进行人工接种试验，设计了7个配方，发酵时间为8 d，研究发酵菌种对酸菜总酸含量和亚硝酸盐含量的影响，确定最适合酸菜发酵的菌种，并研究接种发酵对酸菜的氨基酸含量和挥发性风味物质成分的影响。结果表明，当鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌的比例为1∶1∶1时，酸菜总酸含量升高最快，亚硝酸盐含量最低且无明显的亚硝峰出现，为最适合酸菜发酵的菌种。接种发酵酸菜的氨基酸种类和含量均高于自然发酵的酸菜，挥发性风味物质成分的种类和相对含量均低于自然发酵的酸菜。

酸菜；品质；接种；发酵

酸菜是由蔬菜经乳酸发酵而成[1]，清爽可口、风味独特，被广泛用于多种地方特色菜肴的烹饪，深受人们喜爱。中国传统的酸菜制作方法大都采用自然发酵，此方法利用蔬菜表面附着的多种微生物进行发酵，其中包括大量杂菌，对乳酸菌和一些有益微生物生长繁殖起到抑制作用，存在亚硝酸盐含量较高、发酵周期较长以及品质不稳定等问题，制约了酸菜发酵工业的发展。众多研究表明，人工接种乳酸菌发酵酸菜能够降低酸菜的亚硝酸盐含量[2-4]，缩短发酵时间[5-6]，提高生产效率[7]，并对酸菜的氨基酸含量和挥发性风味成分[8-10]等品质指标均有影响。目前，关于接种发酵对四川泡菜品质影响的相关研究较多，刘春燕等[11]进行了不同乳酸菌接种发酵泡菜风味的研究，侯晓艳[12]研究了不同乳酸菌发酵对泡萝卜品质的影响。然而关于接种发酵对酸菜品质的影响鲜有报道。因此，本试验选用青菜为原料，通过人工接种乳酸菌的方式，从7个乳酸菌配方中选出适合酸菜发酵的菌种，并对接种发酵和自然发酵的酸菜品质进行对比，以研究接种乳酸菌发酵对酸菜品质的影响，旨在为酸菜产业的质量稳定和大规模的工业化生产提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青菜：品种四月青，贵州李记食品有限公司；

鼠李糖乳杆菌6134、嗜酸乳杆菌6243和发酵乳杆菌6233：中国工业微生物菌种保藏中心；

MRS培养基：北京陆桥技术有限责任公司；

纯化琼脂粉：上海博微生物科技有限公司；

电子天平：FA2204B型，上海精科天美科学仪器有限公司；

紫外分光光度计：T6型，北京普析通用仪器有限责任公司；

冷冻离心机：TGL20M型，长沙迈佳仪器设备有限公司；

生化培养箱：SPX-150B-Z型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；

单人单面净化工作台：SW-CJ-IFD型，苏州净化设备有限公司；

高压灭菌锅：LS-375L-I型，江阴滨江医疗设备有限公司；

全自动氨基酸分析仪：L-8900型，日本日立公司；

GC/MS联用仪：HP6890/5975C型，美国安捷伦公司；

手动固相微萃取装置：57300-U，美国Supelco公司；

萃取纤维头：57329-U，美国Supelco公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酸菜发酵工艺 选取新鲜青菜进行清洗、晾晒和切分，试验均选用2 L菜坛，每坛放入相同重量的青菜和盐水(料液质量比为1∶3)，食盐添加量为4%，同时加入发酵菌悬液，菜坛口用水密封，进行发酵。

1.2.2 菌悬液的制备 将鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌3种乳酸菌冻干菌种分别用MRS培养基转管活化三代，分别取两环活化后的乳酸菌于MRS液体培养基中扩大培养，通过离心分离(5 000 r/min)集菌，并且用0.85%生理盐水悬浮，配制3种乳酸菌菌悬液，乳酸菌数均为108～109CFU/mL[13]。

1.2.3 发酵菌种的选择 试验选用2 L容量的菜坛，配制食盐添加量为4%的盐水，每坛放入相同重量的青菜和盐水(料液质量比为1∶3)。基于实验室之前的研究，鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌具有产酸和降解亚硝酸盐的能力，在酸菜生产中广泛应用，因此试验选择这3种乳酸菌用于酸菜发酵试验。以自然发酵的酸菜为空白对照，分别接入发酵菌种，结合前期的试验研究，选用单一乳酸菌、3种乳酸菌两两以1∶1的比例组合以及3种乳酸菌以1∶1∶1的比例组合，接种量为3%。以酸菜的总酸含量和亚硝酸盐含量为指标，每天测定一次，测定时间为8 d，研究不同发酵菌种对酸菜中总酸含量和亚硝酸盐含量的影响。

1.2.4 理化指标的测定

(1) 亚硝酸盐含量：按GB 5009.33—2010执行。

(2) 总酸含量：按GB/T 12456—2008执行。

(3) 氨基酸含量：按GB/T 5009.124—2003执行。

1.2.5 酸菜的挥发性风味物质成分测定 取两种酸菜样品约10 g，分别置于20 mL固相微萃取仪采样瓶中，插入装有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纤维头的手动进样器，在85 ℃条件下顶空萃取30 min后取出，快速移出萃取头并立即插入温度为250 ℃的气相色谱仪进样口中，热解析3 min进样。

(1) 气相色谱分析条件：色谱柱为AB-INowax (30.0 m×250 μm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱，柱温45 ℃(保留2 min)，以4 ℃/min升温至220 ℃，保持2 min；汽化室温度250 ℃；载气为高纯He(99.999%)；柱前压0.052 5 MPa，载气流量1.0 mL/min；不分流进样；溶剂延迟时间：1.5 min。

(2) 质谱条件：离子源为EI源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 618 V；接口温度280 ℃；质量范围20～450 amu。

1.3 数据处理

通过对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索并对Nist 2005和Wiley 275标准质谱图进行核对，确定自然发酵和接种发酵下发酵的酸菜中挥发性风味成分，用峰面积归一化法确定各成分的相对质量分数。

2 结果与分析

2.1 发酵菌种对酸菜总酸含量的影响

由图1可知，在发酵过程中，酸菜的总酸含量随着发酵时间的延长呈上升趋势，接种乳酸菌发酵酸菜的产酸速度均大于自然发酵，且总酸含量高于自然发酵处理。在发酵的第1天，酸菜中总酸含量变化不明显，可能是在发酵初期乳酸菌未能适应发酵环境并且发酵液中仍有其它微生物生长，导致乳酸菌含量不高，酸菜中总酸含量上升缓慢，从第2天开始，乳酸菌大量繁殖，酸菜中的总酸含量明显上升。首先，鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌的比例为1∶1∶1时，酸菜的总酸含量上升最快，其次，两菌种混合发酵酸菜的总酸含量上升速度快于单一菌种发酵的酸菜。不同菌种发酵的酸菜中总酸含量变化趋势基本一致，总酸含量逐渐上升并达到稳定，这是因为随着酸菜发酵时间的延长，乳酸菌大量繁殖，酸菜的总酸含量随之增加。由于接种乳酸菌发酵酸菜能使乳酸菌快速成为优势菌，乳酸菌含量高于自然发酵处理，导致接种乳酸菌发酵酸菜的产酸速度和总酸含量均大于自然发酵处理，而当酸菜的总酸含量上升到一定程度，乳酸菌的生长便受到了抑制，酸菜中总酸含量的上升速度变慢，并逐渐趋于稳定。在发酵第8天时，鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌的比例为1∶1∶1发酵的酸菜，总酸含量最高。这可能是鼠李糖乳杆菌发酵初期产酸较慢，但其具有很强的耐酸能力，在发酵中后期产酸量大；嗜酸乳杆菌产酸快，并且耐酸能力较强[14]，而发酵乳杆菌在发酵初期产酸速度快，但是耐酸能力弱，到发酵后期产酸速度有所下降。因此，在接种量均为3%时，鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌混合发酵酸菜中的总酸含量最高。

2.2 发酵菌种对酸菜中亚硝酸盐含量的影响

由图2可知，随着发酵时间的延长，不同处理的酸菜中亚硝酸盐含量均呈先升高后降低的趋势。接种发酵的酸菜中亚硝酸盐含量上升缓慢，在发酵2 d时达到高峰，其中鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌的比例为1∶1∶1发酵的酸菜中亚硝酸盐含量最低，两种乳酸菌混合发酵的酸菜中亚硝酸盐的峰值低于单一乳酸菌发酵处理，而自然发酵的酸菜中亚硝酸盐含量上升速度快，在发酵3 d时达到最高，且峰值明显高于接种乳酸菌发酵的酸菜。在发酵8 d时，3种乳酸菌混合发酵的酸菜中亚硝酸盐含量最低，自然发酵的酸菜中亚硝酸盐含量最高。在发酵过程中，自然发酵的酸菜中亚硝酸盐含量始终高于接种乳酸菌发酵的酸菜，在发酵8 d时，鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌的比例为1∶1∶1发酵酸菜的亚硝酸盐含量最低，仅为6.05 mg/kg，且无明显的亚硝峰出现，具有良好的食用安全性。这可能是3种乳酸菌对亚硝酸盐均有降解能力，但是在不同的发酵阶段不同菌种对亚硝酸盐的降解率是不同的，因此，在接种量均为3%时，鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌混合作为发酵菌种时，能将酸菜的亚硝酸盐含量始终维持在较低水平。

综合以上考虑，以酸菜的总酸含量和亚硝酸盐含量为考察指标，选择鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌的比例为1∶1∶1作为酸菜发酵菌种，并用于后面的研究。

2.3 接种发酵与自然发酵酸菜中氨基酸含量的对比

接种发酵和自然发酵的酸菜中氨基酸测定图谱见图3。由图3可知，两种酸菜的氨基酸谱图很相似，说明两种酸菜的氨基酸组成很相近。由表1可知，接种发酵与自然发酵的酸菜中均含有丰富的氨基酸，其中接种发酵的酸菜中检测出17种氨基酸，氨基酸总量为8.78 mg/kg，自然发酵的酸菜中检测出16种氨基酸，氨基酸总量为6.19 mg/kg。两种酸菜中的组氨酸和门冬氨酸含量较高，接种发酵的酸菜中组氨酸和门冬氨酸含量分别为2.05 mg/kg和2.14 mg/kg，分别占总氨基酸含量的23.35%和24.37%。其中，门冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和甘氨酸对于酸菜形成良好风味起着重要的作用，而接种发酵的酸菜中这几种氨基酸的含量均高于自然发酵的酸菜。接种发酵的酸菜中检测出了自然发酵酸菜所没有的谷氨酸，谷氨酸和门冬氨酸为植物性鲜味食物的主要呈鲜物质，具有较强的鲜味，因此接种发酵酸菜味道更加鲜美，营养更丰富。

Figure 3 Fingerprint of amino acids in pickled mustard under optimized fermentation and natural fermentation

2.4 接种发酵与自然发酵的酸菜中挥发性风味成分的对比

酸菜的挥发性风味物质总离子图见图4。

Figure 4 Total ion chromatogram of volatile flavor components in pickled mustardunder optimized fermentation and natural fermentation

由表2可知，接种发酵和自然发酵的酸菜中共检出挥发性风味成分68种，主要包括酯类、醇类、烷烃类、烯烃类、醛类、含硫化合物、酮类、酸类和腈类等。接种发酵酸菜的风味成分种类和相对含量都略小于自然发酵的酸菜。

由表3可知，接种发酵的酸菜中检出58种风味成分，风味成分相对含量为96.89%，其中包括酯类12种、醇类6种、烷烃类1种、烯烃类4种、醛类14种、含硫化合物7种、酮类4种、酸类4种、腈类2种和其它种类4种。自然发酵的酸菜中检出61种风味成分，风味成分相对含量为97.95%，其中包括醛类15种、酯类13种、醇类6种、烷烃类5种、含硫化合物5种、酮类5种、烯烃类4种、腈类3种、酸类1种和其它种类4种。

两种酸菜的挥发性风味成分中，酯类化合物的相对含量最高，其中异硫氰酸烯丙酯为两种酸菜的最主要风味成分，相对含量分别为62.78%和56.22%，其次，接种发酵酸菜中异硫氰酸仲丁酯(4.10%)、异硫氰酸异丁酯(1.19%)、3-丁烯基异硫氰酸酯(4.65%)、异硫氰酸戊酯(2.02%)、异硫氰酸苯乙酯(4.17%)和自然发酵的酸菜中异硫氰酸仲丁酯(5.86%)、异硫氰酸异丁酯(1.97%)、3-丁烯基异硫氰酸酯(4.51%)、异硫氰酸戊酯(2.84%)、异硫氰酸苯乙酯(4.33%)的相对含量也很高，同样也是组成酸菜中挥发性风味的主要成分。有研究[15]表明，异硫氰酸酯类物质是以芥菜为原料发酵酸菜的特征风味，在酸菜发酵的过程中，芥菜中芥子苷通过水解作用生成具有刺激性、辛辣味和芳香味的异硫氰酸酯，经检测，自然发酵的酸菜中酯类化合物和异硫氰酸酯类物质的相对含量高于接种发酵的酸菜，可能是接种发酵酸菜时接种了乳酸菌，而乳酸菌能够降低芥菜中的异硫氰酸酯含量，降低了酸菜中的刺激性气味，使酸菜的气味具有较好的接受性。

接种发酵和自然发酵的酸菜中挥发性风味成分种类大多相同，接种发酵酸菜中仅检出1种烷烃，为2,2,6-三甲基环庚烷，而自然发酵酸菜中检出5种烷烃，分别为2,2,6-三甲基环庚烷、3-甲基-正十五烷、十六烷、十七烷和十八烷。接种发酵酸菜中检出7种含硫化合物，分别为二硫化碳、二甲基二硫、烯丙基甲基二硫醚、二甲基三硫、甲基烯丙基三硫醚、二烯丙基二硫和1,4-二甲基四硫，而自然发酵酸菜中检出5种含硫化合物，较自然发酵酸菜少了二烯丙基二硫和1,4-二甲基四硫。含硫化合物对酸菜的风味有较大贡献。接种发酵酸菜中检出4种酮类成分，分别为5-甲基-2-己酮、反式异胡薄荷酮、顺式-3-甲基-5-亚戊基-2(5H) -呋喃酮、香叶基丙酮和β-紫罗兰酮，而自然发酵酸菜中检测出5种酮类成分，较接种发酵的酸菜多了5-甲基-2-己酮。接种发酵下发酵的酸菜中检出4种酸类物质，分别为乙酸、辛酸、苯甲酸和脱氢乙酸。而自然发酵的酸菜中挥发性风味物质中仅检出乙酸1种酸类物质。腈类物质是以卷心菜为代表的蔬菜风味成分，接种发酵的酸菜中检出腈类2种，为3-丁烯腈和苯代丙腈，自然发酵的酸菜中检出腈类有3种，较接种发酵酸菜多了苯乙腈。2-乙基噻吩仅在接种发酵的酸菜中检出，甲氧基苯基肟仅在自然发酵的酸菜中检出。

3 结论

通过研究接种发酵对酸菜品质的影响，发现当鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌的比例为1∶1∶1作为发酵菌种发酵酸菜时，酸菜的总酸含量最高，亚硝酸盐含量最低。接种发酵和自然发酵的酸菜中均含有丰富的氨基酸，接种发酵的酸菜中检测出了自然发酵酸菜所没有的谷氨酸，使酸菜的风味更佳，营养更丰富。接种发酵和自然发酵的酸菜中共检出挥发性风味成分68种，其中自然发酵酸菜中检出61种风味成分，风味成分相对含量为97.95%，接种发酵酸菜中检出58种风味成分，风味成分相对含量为96.89%。两种酸菜中酯类化合物的相对含量最高，其中异硫氰酸烯丙酯为酸菜的最主要风味成分，相对含量分别为62.78%和56.22%。因此，人工接种不仅能加快酸菜的产酸速度，提高总酸含量、降低亚硝酸盐含量，而且对酸菜的风味物质种类和含量也有一定的影响。

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Influence of vaccinated lactobacillus on quality of pickled mustard

MENG Fan-bo1ZHANGWan-ping2WUKang-yun3

(1.GuiZhouInstituteofIntegratedAgriculturalDevelopment,Guiyang,Guizhou550006,China; 2.SchoolofAgriculture,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 3.GuiZhouProvinceHorticultureResearchInstitute,Guiyang,Guizhou550006,China)

The effect of vaccinated lactobacillus on content of total acids and nitrite in pickled mustard vaccinatedL.rhamnosus,L.acidophilus,L.fermentumand their combination was detected in this paper. The influence of fermentation by inoculating the optimal strain combination on content of amino acids and volatile flavor compounds was performed as well. The content of total acid and nitrite in pickled mustard vaccinated a strain combination(L.rhamnosus∶L.acidophilus∶L.fermentum=1∶1∶1) showed the optimum results. It was found that the vaccinated fermentation was superior to the nature fermentation based on kinds and content of amino acids while those of volatile flavor compounds were less in the former.

pickled mustard; quality; vaccination; fermentation

农业科技合作专项计划项目(编号：2013-02)；黔科合重大专项(编号：﹝2013﹞6007)；黔农科院自主创新专项(编号：﹝2014﹞016)

孟繁博，女，贵州省现代农业发展研究所助理研究员，硕士。

张万萍(1970—)，女，贵州大学教授，博士。 E-mail: zwp269@126.com

2016-12-13

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.037