数字PCR在几种常见人类传染病研究中的应用

蒋析文朱小亚 高秀洁 周其伟

·综述·

数字PCR在几种常见人类传染病研究中的应用

蒋析文★朱小亚 高秀洁 周其伟

聚合酶链式反应（polymerasechain reaction，PCR）是现代分子生物学的基础，被广泛应用于核酸的定性及定量分析，是人类传染病病毒核酸分析的核心技术。数字PCR（digital polymerase chain reaction，dPCR）作为一种新兴的核酸定量分析技术，具有高精确度、高精密度等优点。它打破了传统实时荧光定量PCR（quantitative real⁃time PCR，qPCR）技术的局限，不依赖于标准曲线，直接检测样本中靶片段的拷贝数，是一种更为简单且实用的核酸绝对定量分析技术。本文就近几年该技术在人类传染病病毒核酸定量分析方面的研究进行概述。

数字PCR（dPCR）；病毒；核酸

数字PCR（digital polymerase chain reaction，dPCR）诞生于上个世纪90年代末，该技术将反应体系分散到许多独立的反应单元，使得每个反应单元中只包含1分子的靶片段或者不包含靶片段，经热循环反应，直接或通过泊松分布分析阳性反应单元的数目，计算样本中靶片段的起始拷贝数。该技术使用与实时荧光定量PCR（quantita⁃tive real⁃time PCR，qPCR）相同的引物以及探针，无需绘制标准曲线且不依赖于Ct值，对样品中靶片段进行绝对定量，已广泛用于基因差异表达、下一代测序、微生物检测及临床诊断等领域［1⁃6］。

病毒载量是病毒感染诊断和治疗的一个关键指标，一方面用于评价高效抗逆转录病毒治疗的疗效，另一方面用于筛查血清学检验中由窗口期造成的漏检［7⁃8］。qPCR被广泛应用于病毒载量的分析，该方法虽然简易、快速且成本较低，但在靶片段含量较低或抑制物存在等情况下精密度和灵敏度低，且依赖于标准曲线和Ct值［9］。核酸检测方法的精密度对于传染病的的诊断治疗极为重要，即使病毒载量处于低拷贝水平，其少量增加也具有重要临床意义。据研究报道，当人类巨细胞病毒感染者体内该病毒的载量从低于200 copies/mL增加到高于200 copies/mL时会表现出明显的临床症状，而qPCR由于精密度不够高，无法检测出这一变化［10⁃13］。dPCR作为一种新型的核酸分子定量检测技术，具有高精密度的特点，完全可以弥补传统qPCR在精密度方面的缺陷［14⁃16］。临床样本如血液、粪便、石蜡包埋样本等通常比较复杂，常含有大量的PCR抑制剂，研究发现dPCR具有对抑制物的耐受能力强的优点，其扩增效率受抑制物影响小，更适合用于检测复杂的临床样本如粪便、组织样品等［17］。此外一些研究表明dPCR还具有灵敏度高的优点，在检测稀有突变时灵敏度达0.005％，约为qPCR的200倍［18］。因此，该技术逐渐被用于病毒载量分析相关研究，本文就近几年dPCR在几种常见传染病研究上的应用进行介绍，以期为该技术的发展及在传染病方面的应用提供参考。

1 dPCR平台简介

数字PCR的概念于上个世纪末由Vogelstein等［19］提出，具有独特的优势和广阔的应用前景，已飞速地商业化发展。目前基于数字PCR技术的商业化平台主要有2种，一种是芯片式的dPCR（chip digital PCR，cdPCR），该平台以美国FluidigmBioMarkTMHD和Life Technologies QuantStudioTM3D系统为代表，采用微流控技术将混合均匀的PCR反应体系分成若干个独立的反应单元，并将这些反应单元传送至芯片反应室中进行PCR反应，利用类似基因芯片方法分析每个反应室的荧光信号，计算靶片段的数目。另一种是由美国Bio⁃Rad和RainDance先后引进的一个微滴式dPCR系统（droplet digital PCR，ddP⁃CR），该平台将反应液均匀地分散到许多由乳液包裹的微型液滴中（Bio⁃Rad QX200为2万个，RainDance为100～1 000万个），每个液滴都是一个独立的反应单元，通过分析带有荧光信号的液滴数，计算荧光信号的液滴与总液滴的比例，最终计算出靶片段的拷贝数，这种系统与cdPCR相比，原理和操作都更为简单，也更为经济，目前已得到广泛的应用。

2 dPCR在几种常见传染病中的应用

2.1 dPCR在人类免疫缺陷病毒（human immuno⁃deficiency virus，HIV）分析中的研究应用

自1981年获得性免疫缺乏综合征（acquired im⁃ mune deficiency syndrome，AIDS）被发现以来，全球已经有2 000多万人死于此病，我国于1985年发现了首例HIV感染者，至2014年底累计报告的病例有49.7万例，其中接受治疗的患者约有34.4万［20］。对于AIDS的治疗，目前公认的效果最好的方法为高效抗逆转录病毒治疗（highly active anti⁃retroviral therapy，HAART），该方法使AIDS从致死性传染病转变成一种可以被治疗的慢性疾病。2013年，Deb⁃orah等［21］报道了首例被功能性治愈的HIV感染案例，这名被治愈的HIV感染者是一个刚出生的婴儿，在出生30 h后被确诊感染了该病毒，在经过18个月的抗逆转录病毒治疗后发现其体内HIV DNA和HIV RNA的拷贝数及HIV特异性抗体低于检测限，最后利用ddPCR技术确认该婴儿被功能性治愈。病毒载量是评价HAART疗效的重要指标之一，HIV DNA被广泛地用于衡量患者HIV病毒储存库的状态，而2⁃LTR（HIV前病毒核酸在宿主细胞中存在的一种形式）常反映患者HIV病毒动力学特征。据报道，ddPCR在分析HIV DNA和2⁃LTR拷贝数时均具有较高精密度，检测HIV DNA的精密度为qPCR的5倍，检测2⁃LTR的精密度更高，为qPCR的20倍［22］。但也有研究指出ddPCR检测低水平2⁃LTR（HIV前病毒核酸在宿主细胞中存在的一种形式）时变异度较大［23］，由于该研究检测的样本数较少，并没能解释其变异度大的原因。由此可见，ddPCR确实具有精密度高的优点，但在检测低水平核酸时，其检测性能还需进一步的研究来验证。细胞关联的HIV⁃1 RNA（CA HIV⁃1 RNA）被认为是评估病毒量及抗逆病毒疗效的一个潜在的标志。Kiselinova等［24］对44个HIV患者的外周单核细胞样本中的CA HIV⁃1 RNA拷贝数进行检测，发现ddPCR在检测过程中容易产生假阳性，进而导致其线性关系、精确度和敏感性等方面不及半巢式定量PCR。导致PCR出现假阳性原因有很多，如样品间的交叉污染、气溶胶污染等，dPCR灵敏度较高，即使反应体系中存在极少量的污染也会产生假阳性，因此使用dPCR时应更加规范实验操作和实验室设计，以避免假阳性的产生。

2.2 dPCR在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）核酸检测中的应用

HBV呈世界性流行，全世界各地区均有不同程度的HBV感染。据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）报道，全球曾经感染过HBV的人约有20亿，每年大约有100万人死于HBV引起的肝硬化、肝衰竭及原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）等急性和慢性肝病［25⁃26］。Huang等［27］通过ddPCR技术分析感染HBV的HCC患者石蜡包埋的肝脏组织中HBV DNA拷贝数与肿瘤转移、肝癌疾病历程及血清中甲胎蛋白（α⁃fetoprotein，AFP）含量变化的相关性，同时对该技术的检测性能进行评价，结果表明HBV感染是诱导HCC发生与发展的关键因子，ddPCR灵敏度高且特异性强。qPCR为HBV DNA含量分析的常用方法，但用于检测复杂的临床样本时，如石蜡包埋的组织样本，常因量化循环数接近PCR扩增反应的终点而难以精确定量，ddPCR技术在检测中不依赖于Ct值，不受量化循环数的影响，因而更适合用于检测复杂的临床样本。cccD⁃NA是HBV病毒在侵入人体肝细胞后，其部分双链环状的DNA分子以负链为模板延长修补正链的缺口形成的完整共价闭合环状DNA分子。它在细胞中作为HBV病毒转录和复制的模板，在病毒持续感染、抗逆转录病毒治疗后病毒再活化及病毒耐药性方面发挥重要作用。研究发现ddPCR在检测细胞中cccDNA方面具有明显的优势。对HepG2.215细胞DNA中cccDNA含量进行分析，发现在cccD⁃NA含量较低时qPCR精密度急剧下降，且qPCR检测的灵敏度较低，最低检出限为10 ng/μL，而ddP⁃CR的最低检出限为1 ng/μL［28］。

2.3 dPCR在检测丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）研究中的应用

HCV是一种单链RNA病毒，其基因极易发生变异，可分为6个基因型及多个亚型。HCV感染性极强，在全球普遍流行，据WHO统计分析，全球大约有1.85亿人感染该病毒，每年约有35万人死于丙型肝炎及其并发症［29］。持续病毒学应答（sus⁃tained virological response，SVR）是评价丙型肝炎治疗药物疗效的重要指标，而快速病毒学应答（rapid virological response，RVR）和早期病毒学应答（ear⁃ly virological response，EVR）的精确判定对SVR的预测尤为重要，因此高灵敏度的HCV载量检测方法对辅助HCV的治疗极为关键。目前我国已有批准生产的HCV RNA定量检测试剂盒，但灵敏度较低，与我国食品药品监督管理总局制定的标准（最低检出限＜50 IU/mL）相差甚远［30］，根本不能满足临床的需求。Roche TaqMan HCV检测试剂盒在国际上被公认为是HCV RNA定量检测性能较好的试剂盒之一，其灵敏度较高，检测下限为15 IU/mL。比较分析dPCR和Roche TaqMan检测HCV RNA的性能，发现dPCR在其可检测的范围内保持良好线性关系和精密度，但在检测低水平HCV RNA时，与Roche TaqMan HCV存在较大差异，在18个HCV RNA水平低于15 IU/mL的样本中，dPCR检测出22.2％的样本中HCV RNA高于15 IU/mL［31］。目前，dPCR在HCV病毒载量检测方面的研究报道相对较少，还未见有研究对该技术检测HCV载量的灵敏度进行评价。HCV基因组容易发生突变，其编码的核心氨基酸区发生突变会导致肝病的恶化，是演变为HCC的重要因素。ddPCR检测突变灵敏度较高，Mukaide等［16］采用ddPCR的方法对HCV编码的核心氨基酸区的突变进行了分析，同时也将该方法与TaqMan HCV检测方法进行了比较，发现ddPCR在2.5～105拷贝数的检测范围内线性关系良好且灵敏度较高，最低检出限达0.005％，该结果预示着ddPCR在定量分析基因突变方面具有显著优势，有望作为新一代基因突变定量分析工具应用于病毒基因组多态性分析领域。

2.4 dPCR在其他传染病方面的应用

人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HC⁃MV）为疱疹病毒科（herpesviruses）双螺旋DNA病毒，因其感染细胞后，导致细胞肿大而且细胞核内具有巨大的包涵体，所以被称为巨细胞病毒。该病毒在我国广泛流行，研究表明，当机体处于免疫缺陷或免疫系统处于抑制状态时极易感染HC⁃MV，如胎儿、新生儿及孕妇等，除此之外，接受器官或骨髓移植的患者也极易感染此病毒［32］。目前，基于实时荧光定量PCR技术检测HCMV DNA的试剂盒已经广泛应用于临床检验，但其检测的灵敏度和精密度有时并不能满足临床的实际需求。采用qPCR和ddPCR对50个HCMV血浆样本、梯度稀释的HCMV标准品（WHO/NIST）进行定量分析，发现dPCR检测HCMV的精密度较好，但其灵敏度却不及qPCR，还需进一步的优化才能更好的用于HCMV DNA定量分析［33］。另一项研究也利用qPCR和ddPCR技术分析了HCMV血浆样本［34］，但该研究发现ddPCR灵敏度与qPCR并无差异，且其精密度显著高于qPCR。这2项研究表明，ddPCR在检测HCMV时精密度确实较好，但其灵敏度却没有表现出明显的优势，还需要进一步的优化，以提高其灵敏度。单纯疱疹病毒（her⁃pes simplex virus，HSV）是一种双链线性DNA病毒，具有囊膜结构，它能引起人类皮肤性疾病。人类是HSV病毒的唯一宿主，它主要通过感染人类面部和生殖器部位的皮肤和黏膜，引起口角膜炎、唇疱疹、口腔黏膜炎、生殖器疱疹等疾病，HSV感染还与多种疾病关系密切，如流产、胎儿畸形、宫颈癌及阿尔茨海默症等［35］。Azizi等［36］利用dPCR的方法通过检测HSV⁃1转基因细胞系AV529⁃19中HSV编码区UL5和UL29的的拷贝数评价HSV⁃1转基因细胞系AV529⁃19的稳定性，同时对dP⁃CR的检测性能进行评价，结果表明dPCR的稳定性、精确度以及精密度良好。dPCR在传染病方面的应用起步较晚，目前仅在几种常见传染病领域的研究中有所应用。尽管如此，dPCR已表现出其显著的优势和特点，随着该技术的不断创新与发展，在传染病领域的应用前景将会越来越广阔。

3 展望

传染病病毒载量的检测对于传染病的早期诊断、治疗效果评价、病情预测及监测极为重要。而检测方法的灵敏度、精密度和变异度等对检测结果的影响不容忽视，高性能的检测方法有助于对人类传染病的预测及监管，以缩短检测的窗口期并及时的予以治疗。数字PCR不依赖于标准曲线和质控品，直接对核酸进行绝对定量，该技术目前已经逐步的被用于多个领域的研究，且表现出巨大的优势，大量的研究发现与传统qPCR相比，dPCR在检测稀有突变、拷贝数变异及肿瘤相关的mi⁃RNA定量分析方面性能显著提高。dPCR技术发展十分迅速，第一款数字PCR由Fluidigm公司于2006年推出，可同时检测3.7万个独立的反应。随后，QuantaLife推出了微滴数字PCR，被Bio⁃Rad收购并推出新一代的微滴数字PCR QX100可生成2万个液滴进行高通量分析。而Rain Dance Technology于2012年推出的RainDrop™系统通量更大，可生成100万个皮升级液滴。目前这3种dPCR产品中，Bio⁃RadQX100应用较为普遍，主要运用于科学研究领域，且已有的研究报道也暴露该技术还存在一些缺陷，就传染病方面主要包括线性范围比较局限、检测过程中容易产生假阳性、灵敏度也没有显著的优势等。尽管如此，dPCR凭借其现有的优势，已逐步的被运用于临床疾病的诊断，去年我国将该技术列入肿瘤个体化治疗检测技术之一，今年Bio⁃Rad公司推出的微滴式数字PCR技术的第二代产品QX200成功获得欧盟体外诊断产品CE认证，这将极大地促进该技术在临床上的应用。随着该技术的不断发展与完善，相信在不久的将来该技术的缺陷得以弥补，并在感染性疾病诊断、疾病超早期诊断、产前诊断及肿瘤早期诊断等领域发挥不可或缺的作用，成为新一代分子诊断的标准工具。

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The applications of digital PCR on the researches of several common human infections

JIANG Xiwen★,ZHU Xiaoya,GAO Xiujie,ZHOU Qiwei
(DaAn Gene CO.,Ltd.of SunYat⁃sen University,Guangzhou,Guangdong,China,510665)

Polymerase chain reaction(PCR)is the foundation of molecular biology and the core technology for virus nucleic acid detection of human infectious,which can be used for qualitative and quantitative analysis of nucleic acid.Digital PCR is a new technology to quantify nucleic acid,with so many attractive advantages such as high accuracy,precision,and so on.It could give the copy numbers of the sample target fragment directly.Digital PCR is a simpler and more practical method for quantitative analysis of nucleic acid than traditional qPCR.The new technology broke through the limitations of traditional qPCR,working without standard curve.In this paper,the researches of digital PCR on nucleic acid detection of human infectious diseases in recent years are reviewed briefly.

Quantitative real⁃time PCR(dPCR);Virus;Nucleic acid

中山大学达安基因股份有限公司，广东，广州510665

★通讯作者：蒋析文，E⁃mail：yuanyecat@vip.sina.com

注：蒋析文，朱小亚和高秀洁为并列第一作者