丙型肝炎免疫诊断的前景与优势

王秋实郝文波罗树红★

·综述·

丙型肝炎免疫诊断的前景与优势

王秋实1郝文波2罗树红2★

丙型肝炎（hepatitis C，下称丙肝或HC）缺乏特异性的临床表现，其筛查与确诊依赖实验室诊断。近些年，随着基因技术与免疫技术的发展，以及其在临床诊断中的应用实践，对于丙型肝炎的诊断，有了许多新方法。本文从免疫、基因和临床3方面介绍这些新型诊断方法，阐明免疫学诊断在临床应用上的前景与优势。

丙型肝炎病毒；诊断；免疫；基因

世界卫生组织公布，世界范围内有1.7亿丙肝患者，主要经血液或血制品传播［1］。未根治的丙肝会对肝脏造成慢性损害，有可能进一步恶化为肝纤维化及肝硬化，加剧肝细胞的恶变导致肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。由于缺少疫苗，药物疗效差以及诊断时无特异性症状，丙肝成为了一种亟待解决的传染性疾病［2］。丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染的患者只有部分有明显的临床表现，有相当一部分患者表现为隐性感染或成为携带者，对该病的诊断和预防造成了困难［3］。HCV基因组为单正链RNA，长约9.5 kb，由5′端非编码区、编码区及3′端的非编码区构成。HCV的编码区占基因组全长的95％。仅含有单一的开放读码框，编码大小为3 010～3 033个氨基酸的多聚蛋白前体，该前体蛋白在病毒蛋白酶及宿主信号肽酶的作用下，切割为至少10个蛋白，其中3个为结构蛋白，分别是核心衣壳蛋白（core pro⁃teins，C），包膜蛋白1（envelope protein 1，E1）及包膜蛋白2（envelope protein 2，E2），6个非结构蛋白（non⁃structural protein2～5B，NS2～NS5B）。随着生命科学和生物技术的进步，以检测HCV的特异基因和蛋白为基础，出现了许多不同于传统HCV诊断方法的新技术。本文意在从免疫诊断、基因诊断、临床诊断3个方面介绍国内外对于丙肝诊断的新方法、新思路。

1 免疫诊断

HCV从感染到特异抗体产生一般需要50～70天，相较于实时荧光定量聚合酶链反应（real⁃time polymerase chain reaction，real⁃time PCR）定量检测HCV RNA等基因诊断方法，现有的免疫学检测在HCV早期诊断中存在一定缺陷，对预后的判断也不如基因诊断准确［4］。但其检验成本远低于基因诊断等方法，有着广泛的应用前景。

1.1 检测HCV核心抗原

HCV核心抗原水平与慢性丙肝患者HCV RNA感染水平相互对应，常被用来作为HCV复制的间接标志［5⁃8］。核心抗原是在所有HCV基因型中都很保守的结构基因。量化HCV核心抗原检验成本低，可以与HCV RNA检测相互补充，并在诸多人群中得到验证［8⁃11］。该方法成本仅是PCR检测RNA的1/10，适用于需反复检测、长期监测HCV感染的患者［12］。其中The Architect HCV Ag测定法（德国威斯巴登，雅培诊断）具有商业价值。该方法结合化学发光免疫与HCV定性测定，其动态量化范围在3～20 000 fmol/L，对HCV分型有一定帮助。该方法在欧洲已被许可使用，但尚未通过美国食品药品管理局（food and drug admin⁃istration，FDA）的审核，只能应用于科研领域。利用该方法检测慢性丙肝与直接检测HCV RNA相比，成本更加低廉、操作更加便捷。利用酶联免疫法的HCV核心抗原检测试剂盒已在我国获得专利并应用于临床。但HCV抗原检测法的最低检出限（lowest limit of detection，LLOD）对应于HCV RNA为500～3 000 IU/mL，具体数值取决于病毒的基因型［13］。当前丙肝的标准治疗方法是应答指导治疗（response⁃guided therapy，RGT），需要对丙肝病毒基因型进行检测，不同基因型的用药量不同［14］。所以，检测核心抗原的方法忽视了病毒基因型特异性，尚不适用于当前的丙肝诊断与治疗。我们正在进行的研究，就是在检测HCV核心抗原基础上，同时检测NS3、NS4抗原，由于NS3、NS4抗原在不同HCV基因型中存在特异性，故对HCV基因分型有一定的辅助作用，可对丙型肝炎进行综合诊断［15］。

1.2 检测HCV抗体

HCV抗体是临床常见的针对HCV感染的检测指标。美国疾病预防与控制中心（the center for disease control and prevention，CDC）2013年发布的针对诊断HCV临床医生及实验室工作人员指南中，将HCV抗体检验列为对危险人群的初筛手段，抗体检验阳性的样本将继续进行HCV RNA定性分析以明确诊断并做基因型鉴别［16⁃17］。常规方法是通过酶联免疫吸附实验（enzyme linked im⁃mune sorbent assay，ELISA）进行筛查。其原理是用包被在介质上的重组或合成的抗原来捕获样品中的丙肝免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG），被捕获的丙肝抗体与酶标记的二抗结合，随后酶催化底物产生颜色反应，通过颜色变化可判断丙肝抗体检测结果。该方法联合重组免疫印迹试验（recombinant immunoblot assay，RIBA），可有效提高检出率，在临床与科研中，常作为确认HCV感染的标准。RIBA技术是首先在硝酸纤维膜条上包被HCV合成抗原（C，NS4⁃1，NS4⁃2，NS5）以及重组抗原NS3及对照蛋白，进而将硝酸纤维膜条浸泡在稀释的血清或血浆样品中反应后，加入酶标记的抗人IgG抗体温育，如样品中含有HCV特异性抗体，则会形成“包被抗原⁃抗体⁃酶标二抗”复合物，利用显色液显色，最终根据出现的不同条带情况判断结果。优点是检验过程全程自动化，可重复性高，成本较低。其缺点是HCV感染患者出现HCV抗体较晚，检测窗口期长，对处在窗口期内的样本漏检率高，灵敏度低。化学发光酶免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）弥补了ELISA方法的不足，其灵敏度高，检测速度也较快，能缩短检测窗口期，且较基因检测成本低，技术要求也较低，易于普及，主要用于血源筛查及血制品安全性检测。检测HCV抗体的试剂盒已经获国家批准并上市，不同种类试剂盒分别应用胶体金法、酶联免疫法、时间分辨荧光免疫分析法等不同技术。

1.3 床边自测系统（point⁃of⁃care tests，POCT）

床边自测系统是出于对患者的照顾而进行的实验室外检测。它包含基于凝集反应、免疫层析以及免疫过滤的一系列免疫学检测。其基本原理是对患者体液内的HCV抗体进行检测，解决了样品保存的问题，做到了现场取样现场检测。该方法适用于HCV大规模筛查，并提高了没有分子生物学实验室地区的HCV筛查能力。为了替代生物学检查，需要获得全血样本，静脉穿刺取血正在被改进。可以通过诸如唾液收集或指尖取血获得样本。血样还可以通过滤纸收集称为干血点法（dry blood method，DBS），这使得样品可以无污染的存储、运输以及邮寄。HCV RNA可以利用DBS法，结合经典PCR或real⁃time PCR进行量化分析，不过灵敏度会有所降低。欧洲最近批准了以体液和唾液为样本的床边自测检查，FDA还批准了指尖取血和静脉穿刺法。其中口腔样本和血液样本有着更高的灵敏度和特异度［18］。应用该方法检测HCV，对HCV病毒载量最低要求是1 000 IU/ mL［19］。目前FDA许可或批准了16种抗丙肝病毒筛查测试套件。这些方法只用于筛查，确诊HCV还需要补充其他基因、免疫检查法［20］。雅培诊断生产的床旁血液监护系统（Abbott i⁃STAT System）是一种便携式临床分析仪，已通过FDA认证，通过血液样本能对患者人类免疫缺陷病毒（human immunodefi⁃ciency virus，HIV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、HCV等疾病进行筛查，可应用于急诊科与社区医院［21］。

1.4 电化学技术

电化学技术是一种特殊的检测手段，其实验流程是将待检样本与生物学传感器结合，产生生物化学信号，利用电化学原理，如电流滴定法、电导测定法、阻抗及光谱学技术将生化信号转化为电信号，最后利用微电子学收集、分析信号，得出结论。其中的“生物学传感器”可以是依据免疫学原理设计的免疫学传感器，也可以是利用依据DNA的化学结构特点设计的基因传感器［22］。故该技术是一种跨学科、跨专业的综合检验手段，其设计难点是将生物化学信号转化为电信号的过程，目前随着纳米材料的应用，该技术正取得快速的突破，未来将应用于慢性丙肝患者的家庭检测及医院的快速诊断。

2 基因诊断

基因诊断较传统的检测手段可以更直接、更客观的检测病原体或病因，该手段可为疾病防治提供更准确的信息，是医学诊断领域发展的方向。其窗口期短，灵敏度高，易于早期诊断。以re⁃al⁃time PCR为代表的基因诊断技术，是目前临床应用最为广泛的HCV感染实验室诊断方法和确诊手段。

2.1 实时荧光定量聚合酶链反应（real⁃time PCR）

其试验原理为：反转录丙肝病毒RNA，合成互补DNA，并以它为模板做PCR检测。不同于传统PCR的是，real⁃time PCR通过记录反应中扩增子的数量，推导出反应起始阶段临床样本中病毒基因组的数量。为了实现这一目标，在PCR扩增时加入一对引物以及一个特异性荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′⁃3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，释放荧光信号，被检测装置收集。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。用软件来计算每个反应的临界周期，从而绘制与反应起始基因组量的线性关系图。从而检测出样本中HCV的病毒载量［23］。目前，已有2种HCV RNA检测方法应用于临床，分别是雅培实时HCV检测法（abbott real⁃time HCV test，ART）和罗氏COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV检测法（Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV test，CAP/CTM）。ART检测法拥有更高的准确度，而CAP/CTM检测法的预测值更高，故其HCV早期筛查的临床实用性更高［24］。两种方法的最低检出限度基本都维持在12 IU/mL，远高于传统PCR方法（50～100 IU/mL）［25］。real⁃time PCR是目前公认的判断丙肝感染最可靠的方法，临床上被认为是开始干扰素及病毒唑治疗的直接依据。与抗原筛查相比，real⁃time PCR技术存在的不足是RNA不易保存，对实验条件要求高，诊断成本较高，不适用于长期动态监测HCV感染的患者。

2.2 实时转录介导扩增技术（real⁃time transcrip⁃tion mediated amplification，real⁃time TMA）

转录介导扩增技术检测在等温条件下使用两种酶，一种逆转录酶和一种T7 RNA聚合酶。这种扩增包含单链RNA。病毒包膜溶解后，HCV基因组被寡核苷酸探针捕获并绑定到磁性微粒上。扩增涉及两种酶的等温自动催化。每个新合成的RNA作为模板重新进入TMA过程。与real⁃time PCR原理类似，加入特异性荧光探针，通过记录荧光信号计算出样品中最初的HCV含量［23］。该方法可以看做高灵敏度的real⁃time PCR方法，其最低检出限度的病毒量为5～10 IU/mL，与real⁃timePCR均可以用来检测1型、3型HCV病毒血症的最小残留值（2、4型HCV尚不能利用real⁃time TMA方法检测），可用作预后判断。但在病毒血症的长期监测方面的应用有待证实［24］。该方法灵敏度高，但假阳性率随之升高，检验价格昂贵。

2.3 基因芯片技术

新近发展起来的基因芯片技术在基因诊断领域有着重要地位，它可以将生物学中许多不连续的分析过程，移植到固相的介质芯片上，并使其连续化和微型化。其基本原理是通过分子杂交的方法直接对已知核酸序列的病原体基因片段（传染病）和已知突变位点（遗传病、肿瘤等）的基因片段进行检测。目前，诊断病毒性肝炎要依次对甲、乙、丙、丁、戊等肝炎进行筛查，过程繁琐且费时费力。基因芯片技术基于碱基互补的原理，对病原体核酸进行直接检测，将来的诊断芯片有可能同时对所有肝炎病毒进行检测，具有非常大的发展前景［25］。感染性病原体诊断基因芯片就是将待测病原体的特征基因片段（靶基因）固定于玻片上制成检测芯片，将从患者血清中抽提出病原体的RNA经扩增、标记荧光后与芯片进行杂交，杂交信号由扫描仪扫描，再经计算机的分析进行确诊［26⁃28］。目前常用的基因芯片以HCV各基因亚型5′段非编码区（non⁃coding region，NCR）设计特异性探针，与逆转录⁃巢式PCR扩增产物杂交，具有较高的灵敏度和较强的特异性［29］。多种基因芯片已在我国申请专利，由于该方法简便快捷，主要应用于HCV的实验室分型。

2.4 基因测序技术

利用基因测序技术，最经典、最准确的诊断方法为直接测序法，该方法对HCV进行全基因组测序，直接确定病毒基因型，其他分型方法都将该方法视为参考标准，但该方法操作繁琐、工作量大，不适宜在临床上广泛使用。型特异性引物PCR法，结合了基因测序技术与real⁃time PCR技术。该技术基于HCV病毒某部分基因序列在不同亚型间存在较高差异度，如NS5B区基因序列，首先设计引物，进而通过real⁃time PCR技术对特定区段进行定量扩增，最后通过高通量基因测序技术，对扩增产物进行分析，并与各型病毒标准株进行对比，明确病毒基因型。在此技术的基础上，根据不同引物的退火温度不同而设计出型特异性探针退火法。该方法在同一反应体系中加入不同种引物，利用其退火温度不同，对不同区段基因序列进行定量扩增，是目前对HCV变异株进行筛查的常用手段。以干扰素与病毒唑为基础的丙型肝炎抗病毒治疗，其疗程与用药量依赖于病毒的基因分型，故基因测序技术对临床用药及患者预后有着重要意义，是目前临床最常用的病毒分型方法。与免疫诊断相比，其缺点是仅适用于HCV RNA阳性样本，对血清中的病毒量要求高，同时结合了re⁃al⁃time PCR及基因测序技术，其检验成本高，不适用于偏远地区及社区医院。

3 临床诊断

丙型肝炎的患者缺乏典型症状，急性丙型肝炎的临床表现一般较轻，类似感冒，少数患者以头痛、发热、四肢酸痛等症状为主，伴或不伴有全身乏力，食欲减退，恶心、呕吐、厌油、腹胀、肝区痛、尿色加深等症状。轻度慢性丙肝病情较轻，可反复出现乏力，头晕，食欲有所减退，厌油、尿黄、肝区不适、睡眠不佳等症状，肝稍大有轻触痛，可伴有轻度脾大。重度慢性丙肝患者有明显或持续的肝炎症状，如乏力、纳差、腹胀、尿黄等，伴肝病面容，肝掌，脾大。重型丙肝患者在2周内出现极度乏力，严重消化道症状、出现神经、精神症状、表现为嗜睡、性格改变、烦躁不安，昏迷肝性脑病等。由于各型病毒性肝炎的临床表现极为相似，当出现上述症状后，主要依靠实验室诊断对各型肝炎加以鉴别，详细询问患者的既往病史、生活工作环境，明确患者有无输血史、器官移植史、静脉吸毒史对确诊有一定的辅助意义。

4 展望

HCV最大的特点为基因组的高度特异性，不同HCV分离株的核苷酸及氨基酸同源性有较大差异，这种基因变异与丙型肝炎易发展成慢性肝炎、HCV易形成免疫逃逸株以及疫苗研制困难有密切的关系。对HCV的诊断需要结合临床诊断与实验室检测结果。近期发布的欧洲肝病学会临床实践指南提出，以HCV抗体作为HCV感染的一线诊断指标。对于急性丙肝患者及免疫力低下人群，将HCV RNA列入初始评估标准。对于HCV抗体阳性的患者应加做敏感的基因检测。对HCV抗体阳性但基因检测阴性的患者应于3个月后复查。指南推荐对抗病毒治疗的患者，应用real⁃time PCR进行疗效监控［30］。受制于较高的成本，该技术在偏远地区、社区医院以及慢性肝炎的家庭中较难开展。相比之下，免疫诊断速度快、成本低，有着很好的临床应用前景。我们正在研制以核心蛋白、NS3、NS4蛋白为抗原的检验试剂盒。该试剂盒利用抗原筛查技术，对患者血清中的几种病毒抗原进行定量筛查。该试剂盒中的NS3、NS4抗原在不同基因型中的变异较大，相较于传统方法中单独检测HCV核心抗原，既提高了检测的灵敏度，也对病毒的分型、对症治疗给予一定帮助。与针对HCV特异性抗体的免疫学诊断相比，其检验窗口期更短，对HCV感染的早期诊断有积极意义。该试剂盒具有较高的灵敏度，预计检出率在90％以上。该试剂盒虽不能代替基因诊断技术在HCV诊断与分型中的核心地位，但其检验成本低、操作简便、对实验人员要求不高，特别适用于不发达地区及慢性丙型肝炎的长期疗效监测，也适用于门急诊患者的早期快速诊断。不足之处在于该技术的最低检出限受制于免疫检测的先天劣势，仍高于基因诊断技术。由NS3、NS4抗原制备的单克隆抗体，在不同基因型的病毒检测中效价不同，易漏诊某些特殊变异的基因型。

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The prospect and advantages of immunological diagnosis of hepatitis C

WANG Qiushi1,HAO Wenbo2,LUO Shuhong2★
(1.The First Affiliated Hospital of Southern Medical University,Guangzhou,Guangdong,China,510515; 2.Institute of Antibody Engineering,School of Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou, Guangdong,China,510515)

Hepatitis C is difficult to differentiate from other types of infectious hepatitis,as there are no clinical manifestations specific to hepatitis C.The screening and diagnosis of hepatitis C normally depend on laboratory diagnoses.In recent years,with the advancements in gene and immunological technologies,many new ideas have been proffered into the diagnosis of hepatitis C.In this review,new methods for the diagnosis of hepatitis C are discussed from 3 main aspects:immunological diagnosis,gene diagnosis and clinical diagnosis. The prospects and advantages of immunological diagnostics in clinical applications will be explored further.

Hepatitis C virus;Diagnosis;Immunological;Gene

国家自然科学基金面上项目（81271931）；广东省部产学研结合项目（2012B091100158）

1.南方医科大学第一临床医学院，广东，广州510515 2.南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所，广东，广州510515

★通讯作者：罗树红，E⁃mail：sluo815@gmail.com