6种常见的循环肿瘤细胞的分离与富集技术

蒋能 崔咏梅 李淑华 郑晓克 杨峥 王连唐 柯尊富

·述评·

6种常见的循环肿瘤细胞的分离与富集技术

蒋能 崔咏梅 李淑华 郑晓克 杨峥 王连唐 柯尊富★

在过去的几十年，循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）因其在肿瘤的早期诊断、预后判断、疗效评价、靶向药物的开发、个体化治疗中的潜在作用已经受到了广泛的关注和研究。在转移的肿瘤患者中，循环肿瘤细胞被视为一种微创的极具前景的诊断标志和判断预后的重要标志。许多敏感的筛选方法和设备已经应用于血液中循环肿瘤细胞的分离和富集。本文总结了6种CTCs的分离和富集技术以及他们的优缺点，以期为后续更加优化的新技术、新设备的开发提供更多的参考依据，同时也为后续肿瘤的精准医疗带来一些参考。

循环肿瘤细胞（CTCs）；精准医疗；分离与富集

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是指脱离了肿瘤原发部位和转移部位而进入血液循环中的各类肿瘤细胞的统称。根据中国最近的一份肿瘤统计学数据，肿瘤已成为国民死亡的主要原因，同时也是威胁公众健康的主要原因［1］。随着“精准医疗”概念的提出，恶性肿瘤的诊断与治疗也逐步向个体化、精细化方向深入发展，CTCs的研究是精准医疗的重要方向之一，而如何从恶性肿瘤患者血液中分离的CTCs中得到更多的诊断信息和治疗信息将是精准医疗的重要方面，若能应用于医学领域，将有效地帮助发现肿瘤的早期转移、评估肿瘤患者预后以及帮助判断肿瘤个体化治疗的疗效，实时动态地分析肿瘤患者CTCs的特性将为肿瘤患者真正的个体化治疗提供新的依据［2⁃4］。目前的研究表明，CTCs的分离和富集是一种极具前景的恶性肿瘤监测手段［5⁃6］，与传统肿瘤组织活检相比，检测循环血液中的CTCs被视为一种简单无创的“液体活检”手段［2，7，8］。而如何敏感、准确、快速、高效地分离和富集循环血液中少量的肿瘤细胞是摆在我们面前的难题［9⁃11］，CTCs检测技术的不断改进和发展，将有助于我们更深入地了解肿瘤的发生发展过程和其相关生物学特性。本文归纳总结了常见的6种CTCs分离富集技术，包括NanoVelcro cell⁃affinity substrates CTC芯片技术、核酸适配体（Aptamer）技术、微流控芯片技术（microfluidics chip technology）、基于形态学的膜微孔过滤技术（Micro filter technology）、基于形态学的密度梯度离心法等［2，12］。

1 CTCs常见的分离与富集技术

1.1 NanoVelcro cell⁃affinity substrates CTC芯片技术

NanoVelcro CTC芯片能够牢固高效地捕获CTCs，硅纳米结构基质（Silicon nanowire substrate，SiNS）可以模拟细胞外基质的生物学特性和功能，利用纳米基板的生物学特性可以有效地黏附CTCs［2］。此外，可在SiNS上结合上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗体，通过CTCs细胞表面表达的EpCAM抗原与基板上黏附的EpCAM抗体亲和性来有效地捕获血液中的CTCs。通过一系列的改进和创新，NanoVelcro CTC芯片已经经历了3代。第1代是由SiNS和聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）微流体混合器组成，工作部分主要由含有螺旋形（鱼骨型）微通道的NanoVelcro基板和高分子PDMS微通道构成［13］，分离的CTCs通过荧光染色观察，4′，6⁃二脒基⁃2⁃苯基吲哚（4′，6⁃diamidino⁃2⁃phenylin⁃dole，DAPI）染核阳性与CD45染色阳性的细胞为有核白细胞，而DAPI染色阳性与细胞角蛋白（cy⁃tokeratin，CK）染色同时阳性者为需要分离富集的CTCs［2］。临床血液样本对比分析发现NanoVelcro CTC芯片比美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的CellSearch更加敏感、效率越高、花费更少［14⁃16］。同时，分离的CTCs可用于基因测序等后续研究，是精准医疗不可或缺的重要一环［2］。第2代NanoVelcro⁃LMD技术是在纳米基板聚合物基础上通过聚乳酸⁃羟基乙酸共聚物［Poly（lactic⁃co⁃glycolic acid），PLGA］纳米纤维与二甲基二硫代氨基甲酸铅薄膜（Lead di⁃methyldithiocarbamate，LMD）偶联来筛选CTCs［17⁃18］。分离的肿瘤细胞可用来监测肿瘤的进展情况和肿瘤的治疗效果，而分离的单个肿瘤细胞可以用来做下游的基因分型和测序，相比于其他类型的肿瘤活检方式，这种肿瘤的液体活检方式更方便简洁。第3代是温度敏感性的SiNS芯片，可以在37℃条件下捕获CTCs，而在4℃条件下可以释放出捕获的CTCs，这种利用不同温度下SiNS构象的改变来捕获和分离CTCs的特性能更加有效地保持肿瘤细胞的完整性和生物学特性［6，16，19］。除了硅纳米结构基质NanoVelcro芯片，后续的其他很多研究也发现了许多其他的材料，诸如聚（3，4⁃乙烯二氧噻吩）［Poly（3，4⁃ethylene⁃dioxythiophene），PEDOT］来源的NanoVelcro芯片、四氧化三铁纳米芯片等，可能具有更好地分离CTCs的性能［2，20］。纳米的磁性材料或是非磁性的纳米免疫富集方法均可增加分离CTCs时的接触面积，从而增加捕获CTCs的效率。

1.2 核酸适配体（Aptamer）技术

Aptamer技术本质上是一种改进的NanoVel⁃cro cell⁃affinity substrates CTC芯片，传统SiNS基板上结合的EpCAM抗体能够帮助更好地捕获CTCs，新的核酸适配体（Aptamer）技术则是在SiNS基板上连接链霉亲和素及其生物素化的配体，这种基板上的适配体可以有效地识别CTCs细胞膜外表面上的配体，从而达到固定和富集血液中CTCs的目的，而固定的CTCs可在酶的作用下与适配体解离释放，从而达到可控性分离和富集CTCs的作用。这种方法可以减少昂贵的EpCAM抗体的使用，同时也是一种高效的富集CTCs的手段［2，16］。

1.3 CellSearch系统

该系统是目前唯一被FDA批准用于转移性乳腺癌、结直肠癌和前列腺CTCs检测的技术，该系统可集免疫磁珠富集技术和免疫荧光技术于一体，主要依靠外面包被了特异EpCAM抗体的免疫纳米磁珠与血液中表达EpCAM的CTCs结合来分选CTCs，并进一步通过荧光反应识别CTCs，分选效率高，研究表明利用免疫磁珠分离方法可明显增加外周血肿瘤细胞的检出率［21⁃25］。CellSearch系统能够实现CTCs的半自动化检测并且具有较高的敏感性、特异性、准确性和可重复性。但Cell⁃Search每次检测需要7.5 mL血液，所消耗的Ep⁃CAM抗体昂贵，且无法捕获不表达EpCAM的细胞或因发生上皮间质转换导致细胞EpCAM表位丢失的细胞，分离后的细胞可能会因为磁珠无法与细胞完全分离干净而导致细胞完整性和活性受到破坏，导致捕获细胞的再利用受到一定影响。同时，新的研究发现MagSweeper，IsoFlux，VerIFAST系统可能具有更高的富集CTCs的效果［26⁃28］，麻省总医院（Massachusetts General Hospi⁃tal，MGH）的研究团队也发现负向的间接分选机制也有不错的分离效果［29］。

1.4 微流控芯片技术

微流控芯片技术是指根据实际需求，在一些高分子聚合材料上（如PDMS）制作出各种结构尺寸的微米量级管道，血液流体在微流控的微通道中的行为与其在宏观尺度通道中不同，微流控通道可以实现一系列常规方法所难以完成的微加工和微操作。微流控芯片管道可依据细胞大小来设计，微流控芯片分选和富集CTCs也会利用循环肿瘤细胞表达的EpCAM与EpCAM抗体特异性结合来分选CTCs，通过抗原抗体结合抓捕到的CTCs可使用胰蛋白酶使其释放，也可利用细胞的大小、免疫磁珠连同抗体的特异性结合来分离CTCs，微流控芯片是一种高效的分离循环细胞的装置，分离血液中的CTCs效率常常大于90％。微流控被认为在生物医学研究中具有巨大的发展潜力和广泛的应用前景，与常规分选方法相比，微流控芯片具有对细胞破坏小及微型化、低成本、灵敏度高的特点［8，30⁃32］。

1.5 基于形态学的膜微孔过滤技术

Micro filter技术是一种基于肿瘤细胞大小的分离法（Isolation by size of epithelial tumor cells，IS⁃ET）［33］，依据细胞大小设计高分子过滤膜孔径来达到分离富集CTCs的目的［34⁃35］。CTCs与大部分血液细胞在细胞尺寸和变形能力方面存在明显的差别，依据这个原理设计的微过滤膜可以选择性滤过体积较小的血细胞而截留体积相对较大的肿瘤细胞，捕获后的CTCs可通过免疫细胞化学技术、逆转录聚合酶链反应和经典的病理学诊断方法加以识别，Clearbridge和RareCell等平台已应用于实践［2，36］，目前，已发展成3D版膜微孔过滤技术［37］。该方法可以更大程度地保留细胞结构的完整性，而不破坏细胞的生物学特性，为后续的进一步检测提供可能，此方法对技术的要求较低，易于操作，价格低廉，分离后细胞活性较好。该系统一般只依据细胞大小来分离CTCs，与细胞表达的EpCAM、细胞角蛋白等无关，故可以识别所有的CTC类型，避免错误的阳性和阴性结果，但也存在灵敏性不够、细胞易于损失等不足。

1.6 基于形态学的密度梯度离心法

密度梯度离心法也是目前常见的一种基于细胞形态学特点来富集CTCs的方法，可以从外周血中分离富集CTCs，常用的有OncoQuick分离法、传统的聚蔗糖（Ficoll）分离法。传统的Ficoll分离法设备简单，主要设计的是一种特殊的50 mL离心管，离心管下面15 mL用一种特殊的多孔屏障分开，下面15 mL装的是Ficoll，上面装10 mL血液样品，室温下1 000 rpm离心10 min，离心后将上隔间液体倒入一个新的50 mL离心管，下面沉淀的细胞用磷酸盐缓冲液清洗，4℃离心15 min，分离的有核细胞即可用于其它的后续检测。研究同时表明OncoQuick分离法与传统的Ficoll分离法比较，OncoQuick分离法对肿瘤细胞的富集效果更好［12，38，39］。

2 小结与展望

本文总结了几种常见分离CTCs技术的特点，各有优劣。物理的分离方法诸如膜微孔过滤技术和基于形态学的梯度密度离心法操作简单，可分选出发生了上皮间质转化的肿瘤细胞、可更大程度地保持肿瘤细胞的完整性和分子表位，且无需消耗昂贵的EpCAM抗体，但也存在特异性较低和假阳性率较高的缺点。而微流控技术又分了物理的和生物化学的富集方法，物理的方法拥有操作简单、最大程度地保持细胞完整性、无需消耗抗体等优点，生物化学的方法也会利用常见的EpCAM抗体来筛选，在提高富集特异性的同时，其操作成本相应地增加，且因其无法分选出发生上皮间质转化的肿瘤细胞而造成其假阴性率较高。对比其他系统，CellSearch系统同样存在许多优缺点，因其使用了EpCAM抗体，故其具有类似其他的使用EpCAM抗体方法的优缺点，虽其存在耗血量大等缺点，但目前为止，CellSearch系统仍然是FDA唯一批准的用于CTCs检测的系统，故其他物理和化学的分离方法仍然不能完全取代已经标准化了的CellSearch系统。目前CTCs分离技术的研究重点主要集中在纳米材料领域，如本文介绍的纳米Nanovelcro CTC芯片因其具有更大的表面积而增加CTCs的接触面积来达到提高分选效率的目的，且可很大程度地保持分离后CTCs形态和功能的完整性，因许多纳米材料目前仍然使用EpCAM抗体分选，故也存在抗体消耗过多等问题，而改进的核酸适配体（Aptamer）技术无需消耗抗体，这种改进的无需消耗抗体的技术与非磁性纳米材料的结合具有很大的研究潜力。事实上各类技术均有一定的交叉，新的思路可根据实验设计或临床目的先物理筛选后利用抗原表位二次筛选，如何提高分离设备的敏感性、特异性、高效性及如何保持分离后细胞的完整性和活性将是未来CTCs分离富集技术的研究重点。在CTCs分离技术中大量的研究者做了大量的工作，如何标准化CTCs的分离技术也急待解决，要使CTCs检测技术更加广泛应用于临床，还需完善诸多相关研究。

类似于其他医学技术的发展，CTCs分离技术的发展也是为了更好地应用于临床。我们知道远处转移往往是影响肿瘤患者预后最重要的因素，而血液中的CTCs就是肿瘤远处转移的途径，如何从分子学和精准医疗的角度找到肿瘤治疗的钥匙将是未来肿瘤治疗的重点方向，作为一种非侵袭性的血液检测手段，分离纯化后的CTCs可用来培养细胞系做相关研究，可用于基因测序分析突变位点，可用于制作动物模型，CTCs的相关研究将为肿瘤的早期诊断、疗效评价、预后判断、靶向药物的开发和药效评估以及个体化治疗提供可靠的依据。正是因为CTCs广阔的应用前景，优化的CTCs分离和富集技术的开发显得尤为重要。

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6 kinds of common technologies of separating and enriching circulating tumor cells

JIANG Neng,CUI Yongmei,LI Shuhua,ZHENG Xiaoke,YANG Zheng,WANG Liantang,KE Zunfu★
(Department of Pathology,the First Affiliated Hospital,Sun Yat⁃sen University,Guangzhou,Guangdong,China, 510080)

During the past ten years,circulating tumor cells(CTCs)have received enormous attention as potential research direction,because of the potential value in the early diagnosis of cancer,prediction of clinical prognosis,evaluation of therapeutic efficiency,development of targeted drugs,and personalized medicine of malignant cancer.Circulating tumor cells(CTCs)have been regarded as minimally invasive and promising diagnostic and prognostic biomarkers for patients with metastatic tumors.Multiple highly sensitive approaches and devices have been developed to separate and enrich CTCs in the blood.We have summarized 6 kinds of separation and enrichment technologies of CTCs with the opportunities and challenges faced during the development of these systems,this article also provides reference frame for an optimized separation and enrichment technology and highlight some directions for the precision medicine of cancer treatment.

Circulating tumor cells(CTCs);Precision medicine;Separation and enrichment

国家自然科学基金（30900650/H1615，81372501/H1615，81572260/H1615，81172232/H1615，81172564/H162）；广东省自然科学基金（2011B031800025，S2012010008378，S2012010008270，S2013010015327，2013B021800126，20090171120070，9451008901002146，2013B021800126 2015A020214010 and 2013B021800259）；高校基本业务青年重点培育（2015ykzd07）

中山大学附属第一医院病理科，广东，广州510080

★通讯作者：柯尊富，E⁃mail：kezunfu@126.com