土拨鼠肝炎病毒动物模型在肝细胞癌研究中的应用

朱松山殷君黄华艺，3★

·综述·

土拨鼠肝炎病毒动物模型在肝细胞癌研究中的应用

朱松山1殷君2黄华艺1，3★

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）是一种广泛存在的人类病原体，可引起肝炎、肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）。HBV感染严重威胁人类的健康，尤其以我国和东南亚国家为甚。慢性乙型肝炎和因慢性HBV感染而导致的HCC的发病机制、诊断和治疗仍是一个很具挑战性的课题。目前研究病毒性肝炎以及肝炎后肝硬化和HCC的发病机制和诊治很大程度上依赖于动物模型，而良好的动物模型的选择是决定研究结论是否可靠的基础。土拨鼠是一种主要生活在北美大平原的动物，其个体和肝脏大小特征、携带的土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus,WHV）的致病机制，疾病进展与人HBV相似性等因素很利于研究乙肝病毒性肝炎和HCC的发生和发病机制、诊断与治疗。因此，通过土拨鼠肝炎动物模型能更好地了解HBV与HCC的复杂关系并将促进更好的预防和治疗新策略的制定。本文就土拨鼠动物模型在乙型病毒性肝炎以及HCC研究中的应用进展做一概述。

土拨鼠；乙型肝炎病毒；动物模型；肝细胞癌

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种广泛存在的人类病原体，可引起肝炎、肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。现在约有2亿4 000万例慢性乙肝病毒携带者，每年约有620 000例死于乙肝相关的肝脏疾病，其中，HBV引起HCC的诊断和治疗仍存在很大的挑战［1］。动物模型是研究乙型病毒性肝炎和HCC常用的有效方法。土拨鼠携带的土拨鼠肝炎病毒（woodchuck hepatitis virus，WHV）与人HBV相似，因此，土拨鼠肝炎病毒动物模型得到了广泛的使用，通过研究土拨鼠肝炎病毒动物模型能更好地了解HBV感染导致HCC发生的复杂机制并将促进更好的预防和治疗新策略的制定。本文就近年来，土拨鼠肝炎病毒动物模型在HCC中的应用进展做一概述。

1 人乙型肝炎病毒性肝细胞癌动物模型概况

HBV对宿主有严格的选择性，除人类和大猩猩外，难以感染其他动物。黑猩猩是最理想的实验动物模型，曾广泛被用于HBV感染的研究。但是受动物来源和伦理因素的影响，其使用越来越受限制。

HBV转基因小鼠可使小鼠直接感染HBV，允许异体移植细胞在体内存活，这是一种评价和比较抗乙肝病毒药物较理想的动物模型［2］，其缺点是造模难度大，繁殖率低，死亡率高。

树鼩与灵长类动物的一些神经受体蛋白基因之间的同源性程度高，因此树鼩也被用于肝癌动物模型，尤其是在地域性的毒理学和病毒学研究中。但是，HBV在树鼩体内感染属一过性且缺乏稳定性，不利于感染后的评价。

鸭乙型肝炎病毒也属嗜肝DNA病毒，其来源广，成本低，可在一定程度上了解HBV的感染复制周期及宿主免疫系统。但是鸭子与人类的遗传差异较大，使鸭乙型肝炎病毒模型的使用受到了限制。

土拨鼠动物模型携带WHV的DNA病毒结构和复制的生命周期与HBV相似，在核心蛋白的装配结构域序列（分别为wcp149和hcp149）有高达65％的一致性［3］，可引起急性和慢性肝炎。此外，慢性感染WHV的土拨鼠通常在感染后2～4年会导致HCC的发生。在土拨鼠模型上长期使用抗病毒核苷疗法已可以对HCC进行预防，同时也展示了治疗HCC的创新性的分子生物学方法。

2 土拨鼠和WHV

土拨鼠属啮齿类动物，平均体重为4.5 kg，最大可成长至6.5 kg，身长约为56 cm。土拨鼠主要分布于北美大草原，新生土拨鼠约3个月后即达到成熟期，其寿命可以长达10年之久，每天以素食为主，一天最多可以吃上5 kg的绿色蔬果，其价格相对低廉，一只约1 500元人民币左右。使用土拨鼠的研究始于1978年，当时发现土拨鼠对WHV有着很高的感染率，并有很高的慢性肝炎和HCC患病率。后来研究发现，WHV携带有相关的HBV基因，并且其基因组具有复制能力，可用来感染土拨鼠［4］。

3 土拨鼠肝炎病毒动物模型

在基因组多样性的肝癌细胞中，HBV相关的肝癌基因组显示有较高的不稳定性，可能是由于HBV DNA整合到宿主细胞基因组，引起染色体改变和癌基因的插入突变。土拨鼠模型是研究HBV感染的信息模型，包括宿主的免疫反应和慢性HBV感染的免疫疗法［5］。WHV在靶向器官、形态学、分子生物学、基因的遗传结构、流行病学、致病机制、疾病的进展等方面与HBV有着高度的相似性。在研究HBV感染人类的发病机制方面，土拨鼠感染WHV已被公认为是对HBV感染和HBV引起的肝脏疾病研究最合适的模型，其用途超越其他现有的天然和转基因动物模型［6］。通过土拨鼠动物模型能更好地了解HBV感染导致HCC发生的复杂机制并将促进更好的预防和治疗策略的制定［7］。

4 土拨鼠肝炎病毒动物模型的应用

4.1 WHV感染的自然史

大多数慢性HBV的感染发生于新生儿期，因此，利用新生土拨鼠接种WHV后发现，几乎所有的土拨鼠发展成HCC的潜伏生存期为24个月，并且平均预期寿命为30～32个月。目前，大多数模型所用的WHV是WHV7或WHV8毒株，其序列具有很高的相似性。同时，WHV野生型毒株（WHVNY）和WHV7毒株表现出类似的复制水平和引起成年土拨鼠急性感染的能力［8］。新生土拨鼠感染WHV7P1通常有60％～75％成为慢性携带者，2年慢性携带者50％转为HCC，4年慢性携带者接近100％转为HCC，很好地模拟了人慢性HBV携带者的病程［9］。与慢性肝炎相似，慢性WHV感染及终身病毒复制活跃的土拨鼠均不可避免的进展为慢性肝炎和HCC。在慢性感染的土拨鼠，e抗原不会刺激机体产生e抗体来抑制病毒的复制，而这种现象在慢性HBV感染是常见的。慢性WHV感染的土拨鼠，当发生病毒活跃复制伴随表面抗原和e抗原表达升高时，反映了机体产生对病毒的免疫耐受，这种过程与HCC的进展有密切联系。

4.2 土拨鼠肝炎病毒动物模型在人肝细胞癌发病机制研究上的应用

4.2.1 土拨鼠肝炎病毒动物模型免疫学的研究

在HBV感染过程中，HBV进入肝细胞如何导致疾病的发生，其机制尚不清楚。WHV和HBV均有明显的抗原交叉反应，抗原、抗体在肝脏和血液循环中出现的时间相似，并且病毒诱导的特异性体液免疫和细胞免疫应答和急性肝炎向慢性肝炎和肝癌的进展机制也有较相似的过程［10］。土拨鼠最常见的感染方式是单独感染WHV。感染后土拨鼠的肝细胞嗜碱性增加，这种在形态上改变的病灶，可能是癌前性质的病灶。但是，多数不能检测出WHV表达的蛋白质和核酸，因此可以假设肝细胞失去表达WHV的能力，使这些肝细胞逃避免疫介导的细胞死亡，并进行克隆扩增，从而形成明显的病灶［11］。土拨鼠在非常低剂量肝炎病毒感染时毫无症状，血清学也检测不出，但是在分子水平上表现为持续感染。它的主要表现是原发性隐匿感染（primary occult infection，POI），通过激活免疫系统，引发病毒特异性T细胞反应，病毒特异性T细胞反应是持续隐匿性肝炎的一个非常敏感指标，但是缺少了抗病毒抗体的诱导［12］。Mulrooney⁃Cousins等人［13］的研究发现，给10只新生土拨鼠注射含10或100病毒颗粒的WHV诱导POI的发生，所有动物均可在血清中检测出感染病毒的DNA（＜100～200 copies/mL）和循环淋巴细胞，但血清中WHV表面抗原和抗WHV核心抗原仍然终生检测不到，这一点与人感染HBV后检测不到核心抗原相似。引起POI阳性的病毒属于野生型序列，可感染健康的土拨鼠并引起肝炎和HCC。其原因是病毒核酸整合到宿主的肝脏和免疫系统的基因组，保留致癌的效力，并能够引起在肝脏中的致病性传播。

4.2.2 土拨鼠肝炎病毒动物模型分子病毒学的研究

WHV的生命周期也与HBV相似，病毒DNA需整合到宿主基因组中，从DNA逆转录为RNA。当WHV整合到宿主细胞的DNA时，它通常是可以针对任意数量细胞的DNA位点进行截断和重排，这成为导致HCC发生的重要因素［14］。在感染的肝细胞中游离的cccDNA被认为是持续稳定的，因此消除感染的肝细胞是非常困难的。对于如何维持慢性肝炎病毒感染的决定因素尚未得到充分的认识。过去普遍认为，慢性肝炎病毒感染仅能通过已感染的肝细胞的分裂来维持，而不能通过病毒的传播。但是有研究表明［15］已经被WHV诱导成HCC的土拨鼠，再同时感染另一毒株WH⁃VNY时，在土拨鼠的血清样本中发现WHVNY松弛的环状DNA，肝脏和肝癌组织中检测出了WH⁃VNY RNA的复制衍生物和WHVNY RNA复制中间体，这表明肝炎病毒感染和细胞之间的传播可能会持续发生，肝炎病毒持续、重叠感染和传播局限性对于维持慢性感染状态具有意义。WHV感染成年土拨鼠会导致急性肝炎，而感染新生土拨鼠会引起慢性肝炎，慢性肝炎可发展成HCC。利用这一点，土拨鼠模型可作为研究慢性乙型肝炎发病机制及向中晚期肝病发展的理想动物模型。

在研究来源于X/c⁃myc双基因的小鼠和WHV感染的土拨鼠时发现，Suz12/PRC2目的基因亚单位在乙型肝炎病毒复制及HBV X蛋白相关HCC的发生过程中激活，而且Plk1和Suz12/Znf198在肝脏肿瘤中有相同的作用。在HBV复制的肝癌细胞中Suz12抑癌基因和细胞增殖基因被诱导，它们在X/c⁃myc双基因的HCC进展期间表现出独特的表达谱。具体来说，在X/c⁃myc双基因的肝脏增生和癌前阶段，CCND2、EpCAM和IGFII的表达升高，而在X/c⁃myc双基因的小鼠和WHV感染的土拨鼠其BAMBI和PLK1过度表达［16］。利用逆转录PCR的结果证实了土拨鼠基因（SAT、IDH3B和SCD）具有差异性表达。差异表达的基因参与了转录、剪接、翻译、细胞周期代谢、蛋白质折叠、降解、细胞凋亡、免疫反应和金属结合等过程［17］。

土拨鼠肝癌模型与人肝癌细胞中肝蛋白的糖基化模式相似，利用二维凝胶蛋白质组学耦合的方法已经证实了一种像高尔基体蛋白73的糖蛋白，在土拨鼠肝癌模型中升高和超岩藻糖基化，这可以成为识别癌症的标志［18］。载脂蛋白A⁃I（apo⁃lipoprotein A⁃I，ApoA⁃I）是血清中高密度脂蛋白颗粒的主要蛋白成分，血浆中ApoA⁃I亚型的改变是土拨鼠、人类慢性肝炎和HCC的标志［19］。

在观察雄性土拨鼠和雌性土拨鼠时发现，雄性土拨鼠中病毒具有更高水平复制活性，表明雄激素可以调节WHV的复制，这一现象与人HBV感染相一致［20］。因此，在相同条件下，性别或许也是HCC形成的重要因素。肝癌细胞中酶活性的改变也是临床观察的一个指标。目前新开发了一种利用定量分光光度法对乙酰辅酶A合成酶含量的测定，通过观察比较土拨鼠肝癌组织与周边邻近区域的组织发现，癌组织中乙酰辅酶A合成酶活性显著增加，并且肝癌组织的亚细胞组分中的乙酰辅酶A合成酶活性也明显高于周围组织［21］。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在人HCC的侵袭和转移中发挥核心作用，主要表现为肝癌组织中的MMPs表达增加。同样，这一现象也在WHV感染土拨鼠的肝组织中观察到，MMP⁃1、MMP⁃2、MMP⁃7、金属基质蛋白酶组织抑制剂⁃1和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白水平升高。MMP⁃9在HCC的表达明显高于没有感染WHV动物的肝脏，而土拨鼠MMPs的活性可被金属蛋白酶抑制剂抑制，这是一种常见的哺乳动物MMPs抑制剂。这些结果表明MMP抑制剂可以作为一个潜在的HCC的治疗策略［22］。

许多基因在人类HCC有差异表达。进一步探讨在土拨鼠肝癌组织中部分差异表达基因及相关蛋白的表达能进一步研究人类乙肝病毒性肝癌的发病机制和治疗策略。

4.3 土拨鼠肝炎病毒动物模型在人肝细胞癌的诊断和治疗上的应用

4.3.1 在新型影像学技术诊断中的作用

慢性HBV感染与大部分的HCC密切相关。但是诊断为HCC时往往已在疾病的晚期，此时可实施的治疗方案很有限而且预后差。因此我们需要一种易检测、特异性高的方法，有助于HBV诱发HCC的早期检测和治疗。肿瘤的生长用磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）检测，肝脏的损伤程度用肝功酶谱检测。丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶的升高表示随着肿瘤的生长导致肝功能损伤加剧。在MRI中，正常的肝脏界限清晰，因大量血管聚集，HCC区域表现为高信号。在肿瘤结节区，肝脏形状显示不规则，无限增殖的细胞会有混杂信号。此外，肝细胞癌土拨鼠模型2⁃脱氧⁃2⁃［F⁃18］氟⁃D葡萄糖正电子发射断层扫描成像与组织学也有一定的相关性，利用影像学技术，HCC的进展可用MRI进行可视化分析，同时对照血清检测结果，两者结合可以增强对HCC进展的了解，做到早发现，早治疗［23⁃24］。

4.3.2 土拨鼠肝癌药物治疗

对于HBV感染的治疗，主要是针对慢性HBV感染者肝内及血清中病毒DNA复制的抑制而减少病毒载量的手段，结合适当的免疫调节药物达到联合治疗的目的。尽可能减少cccDNA的稳定性，直到可以减缓或消除细胞中病毒的复制。因此，使用抗病毒药物治疗是目前常规的方法，常见的如接受克来夫定、恩替卡韦治疗时，它对土拨鼠具有特别强有力及持续有效的抗病毒活性，其弊端是常常导致耐药突变株的出现［25］。因此，现在多联合药物和疫苗共同治疗，其益处如下：（1）降低病毒血症、抗原血症以及降低HBV DNA和RNA水平；（2）对慢性肝炎进展的抑制作用；（3）降低慢性肝损伤的频率和延迟HCC的发病，而这些手段的试验往往依赖于土拨鼠肝炎病毒动物模型的帮助［26］。

4.3.3 土拨鼠肝癌免疫治疗

免疫疗法是通过免疫调节慢性乙肝病毒携带者的体液免疫和细胞免疫应答，从而提高治疗的准确性，减少了治疗的副作用。Huang等人［27］在土拨鼠肝癌模型上采用含有两个细胞因子和血管生成抑制因子混合类型的策略对HCC进行治疗，与抗血管生成或细胞因子基因的单一疗法相比，前者在大块肿瘤的治疗上有更好的效果。在浸润型肿瘤中，混合免疫治疗显著提高了CD3（+）T细胞的水平，并能显著减少肿瘤血管的发生。此外，它诱导高水平的自然杀伤细胞的生成和细胞凋亡的发生，减少在肿瘤区域的免疫抑制效应物水平。因此，抗血管生成治疗可能提供的优点是减少大块肿瘤的免疫耐受，使它们更容易接受到免疫效应。这种联合治疗将来有可能有效地治疗晚期肝癌患者。

干扰素是一种多效性细胞因子，能诱导干扰素刺激基因的表达，具有直接的抗病毒和免疫调节性能［28，29］。Semliki森林病毒（semliki forest vi⁃rus，SFV）可诱导表达白细胞介素⁃12（interleukin⁃12，IL⁃12），可以对WHV和HCC产生免疫反应。瘤内注射相关的SFV载体可以表达荧光素酶和IL⁃12，导致肝癌细胞内和血清中分泌一种高活性因子，促使表达相关的γ⁃干扰素、α⁃肿瘤坏死因子和外周血单个核细胞的产生，从而引起癌细胞的坏死，这两种物质分别表明SFV载体对土拨鼠肿瘤细胞有效［30］。但是，慢性WHV感染的肝脏中，IL⁃12免疫刺激诱导强烈的免疫反应，却抵消了治疗的抗病毒效果，这可能是调节性T细胞在慢性病毒性肝炎相关的免疫应答中起冲突作用［31］。但是，Nowrouzi等人［32］利用胎鼠模型也揭示了逆转录病毒基因治疗载体的潜在遗传毒性。因此，近年来，直接利用Toll样受体激动剂可以诱导Ⅰ型干扰素信号通路活化，发挥抗病毒作用，并且可避免全身不良的免疫反应［33］。由此来看，土拨鼠肝癌模型在HCC的联合治疗包括免疫治疗给人们提供了一个可靠有效的模型。

5 总结与展望

用WHV感染土拨鼠是目前最具代表性的制备慢性HBV感染的动物模型。其为人们阐明了HBV的复制方式、生命周期、cDNA信息导向机制、宿主的免疫反应与致癌机制等［34］。病毒性诱发型肝癌的土拨鼠模型已被有效地用于开发抗病毒药物、免疫调节治疗方法以及超声与磁共振成像增强肝肿瘤的新显像剂的研发。随着在土拨鼠动物模型上对WHV致病机制不断深入的研究以及新治疗方法不断探索所获得的经验，我们相信，在不久的将来，人类将显著提高对慢性HBV感染及其后遗症根除性治疗的成功机率。

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Application of woodchuck hepatitis virus animal model in the study of hepatocellular carcinoma

ZHU Songshan1,YIN Jun2,HUANG Huayi1,3★
(1.Department of Laboratory Medicine,the People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning,Guangxi,China,530021;2.Department of Laboratory Medicine,the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanning,Guangxi,China,530023;3.Department of Surgical Oncology,Roswell Park Cancer Institute,Buffalo,New York,USA,14263)

Hepatitis B virus(HBV)is a widespread human pathogen that can cause hepatitis, cirrhosis,and hepatocellular carcinoma(HCC).HBV infection has been a serious threat to human health, especially in China and Southeast Asian countries.The pathogenesis,diagnosis and treatment of chronic hepatitis B and HBV caused HCC are still very challenging.Currently,understanding of the pathogenesis and diagnosis of viral hepatitis,liver cirrhosis post hepatitis,and HCC are largely dependent on the animal model system,and the choice of a well⁃established animal model is the basis in accomplishment of the study.The features of woodchuck body weight,the size of its liver,the pathogenesis of the hepatitis B virus it carries,and the progress of the disease course are very similar to those of human hepatitis B virus,thus,the woodchuck is a very useful animal model in hepatitis B virus infection and in the study of the development,pathogenesis, diagnosis,and treatment of hepatitis B and HCC.Therefore,the woodchuck hepatitis B virus animal model enables us to have a better understanding of the complex relationship between HBV infection and HCC.It will also promote a better prevention and treatment strategy for hepatitis B infection.In this paper,recent reports in the application of the woodchuck animal model in the field of hepatitis B and HCC will be summarized.

Woodchuck;Hepatitis B virus;Animal model;Hepatocellular carcinoma

1.广西壮族自治区人民医院检验科，广西，南宁530021 2.广西中医药大学第一附属医院检验科，广西，南宁530023 3.美国罗斯威尔帕克癌症研究所肿瘤外科，美国，纽约，布法罗14263

★通讯作者：黄华艺，E⁃mail：Huayi.Huang@Roswellpark.org