基于TOF MS-IDA-MS/MS分析穿山甲炮制前后的成分变化

袁娟娟,刘 逊

1.江苏省昆山市中医医院(昆山215300)，2.苏州卫生职业技术学院(苏州 215009)

·方药纵横·

基于TOF MS-IDA-MS/MS分析穿山甲炮制前后的成分变化

袁娟娟1,刘 逊2△

1.江苏省昆山市中医医院(昆山215300)，2.苏州卫生职业技术学院(苏州 215009)

目的：探讨穿山甲炮制增效的机理。方法：采用TOF MS-IDA-MS/MS对穿山甲炮制前后成分变化进行研究，Waters C18色谱柱(2.1 mm × 150 mm，1.7 μm)；柱温40 ℃。流动相为0 min，乙腈-水(5∶95)，30min乙腈-水(95∶5)；体积流量0.4 ml/min。质谱定性采用电喷雾离子源(ESI)的飞行时间质谱，负离子模式下采集数据，利用Markerview分析软件对化合物进行筛选，通过精确相对分子质量和二级质谱裂解碎片鉴定监测到的化学成分。结果：经过PCA分析，可以很好地区分穿山甲炮制前后成分的变化，穿山甲经炮制后，新增丝-酪环二肽及苯丙-脯环二肽等四种成分。结论：穿山甲经高温炮制后环二肽等亲水性成分含量显著增加。

穿山甲为鲮鲤科动物穿山甲(Manispentadactyla)的鳞甲，性咸，微寒，具有通经下乳，消肿排脓，搜风通络的作用[1]。穿山甲对诸多急慢性疾病均有良好疗效，例如不孕症、月经不调、产妇乳汁不下、乳腺疾病妇科疾病等；夜啼、厌食症等儿科疾病；血管神经性头痛、震颤麻痹、心绞痛、高脂血症、白细胞减少症、泌尿系及胆道结石、血栓性静脉炎、前列腺增生症等其他疾病。在中药传统方剂和古代医书中穿山甲起主治疗效的方剂多达489个[2]。穿山甲主要含有硬脂酸、胆固醇、二十三酸丁胺、脂肪族酰胺等脂溶性成分以及蛋白质类大分子成分，而且穿山甲鳞片的蛋白质是是由α角蛋白和β角蛋白两种结构组成。主要成分是β角蛋白，以及部分α角蛋白[3]。前期对穿山甲炮制的研究主要集中在传统工艺改良上，如对穿山甲大小分档，炮制辅料和砂烫温度，时间的研究[4]，或是将传统砂烫工艺改良为微波炮制，膨化炮制及烘法炮制[5]。目前，国内学者针对于炮制前后穿山甲成分变化的研究多是红外[6]，X衍射谱图的变化[7]，炮制前后氨基酸含量的变化[8]，肽类谱图的变化[9]，较少涉及到炮制前后短肽类成分的变化[10]，穿山甲在炮制过程中成分有没有发生变化，有哪些成分发生变化，是本实验的研究重点，所以本文拟对穿山甲的生品和炮制品，利用TOF MS-IDA-MS /MS分析其炮制前后具体化学成分的变化[11]，为穿山甲炮制增效的研究提供一定的理论依据。

材料与方法

1 材 料 本实验所用材料中国穿山甲(Manis pentadactyla) 药材样品1份，来源于苏州卫生职业技术学院馆藏标本，炮制品为同批药材经作者砂烫加工，样品均由作者鉴定，凭证样品保存于苏州卫生职业技术学院标本馆。

2 方 法

2.1 色谱条件：Waters C18色谱柱(2．1 mm × 150 mm，1．7 μm)；柱温40 ℃；流动相为0 min，乙腈-水(5：95)，30 min乙腈-水(95：5)；体积流量为0．4 ml/min。

2.2 质谱条件：采用TOF MS-IDA-MS /MS模式；负离子检测模式；电喷雾离子源(ESI)；离子源温度 (TEM)550℃；雾化器电压(GS1)55 psi；辅助加热器电压(GS2)55 psi；气帘气(Curtain Gas) 36 psi；喷雾电压(IS)-4500 eV；去簇电压(DP)-100 eV；碰撞电压(CE) -40 eV；碰撞电压差15 eV；扫描范围控制在m/z 50-800。

2.3 供试品溶液的配制：取本品药材粗粉0．2 g，精密称定，置10 ml容量瓶中，加入50 %甲醇，并定容至10 ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)60 min，取出，放冷，用50 %甲醇补足减失重量，摇匀。取适量，离心(12000 r/min，5 min)，取上清液，过0．45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 统计学方法：利用Analyst TF 1． 6软件采集数据，通过Markerview 1．2．1软件进行处理，通过PCA分析寻找炮山甲与生品谱图之间的差异，同时检索质谱数据库，对成分进行快速鉴定。

结 果

谱图中各色谱峰分离度良好，炮山甲与药材的谱图存在差异。通过PCA分析，炮制品组，药材组差异明显，说明穿山甲经过炮制化学物质谱发生了较明显的改变。通过穿山甲炮制品组，药材组的载荷矩阵图对图中各个变量进行分析，搜索穿山甲炮制前后变化的化学成分。图中的各点表示各个m/z质荷比，tR为保留时间的变量，点与图中心点的距离表示了该变量对样品分型所做出的贡献大小，偏离越远的点，其在不同样品中的含有量变化越大，经过比较，发现穿山甲经砂烫炮制后显著变化的有6个成分(见表1)。通过质谱数据分析，结合文献研究，推测化合物1、5分别是丝-酪环二肽[4]及苯丙-脯环二肽[12]。对此6种差异性成分进行提取，得到相应的积分值，比较穿山甲炮制前后相关成分的变化趋势可知，砂烫后，出现了丝-酪环二肽及苯丙-脯环二肽以及两个未知成分另外两种成分量显著升高。

讨 论

穿山甲生品不入药，经炮制后才具有通经下乳，消肿排脓等功效，作为极具中药特色的传统炮制，在影响中药临床疗效及质量上起着极其重要的作用。目前对于穿山甲炮制机理的研究主要集中在砂炒、醋炒、挫碎等穿山甲炮制品的氨基酸含量或是浸出物的比较。醋山甲的水溶性浸出物比烫山甲的水溶性浸出物增加28.99%～40.94%，穿山甲经炮制后，蛋白质含量会随着温度的升高而降低，并且经醋制后炮山甲中蛋白质含量会变低低。挫碎的穿山甲与砂炒、醋炒后的游离氨基酸相比，含量最少。醋炒比砂炒的氨基酸量稍高。炮山甲水煎液中没有分子量4000 Da以下的多肽。对于炮制前后穿山甲环肽类成分的变化很少。穿山甲炮制后药效的改变这可能是由于穿山甲鳞片中的特殊高酪氨酸蛋白发挥着作用，穿山甲片在砂烫高热处理过程中，角质层和釉质层产生了不同程度的破坏，可能致使大量高酪氨酸角蛋白降解，角蛋白会被分解为各种多肽及其他产物，含有酪氨酸或是其他碎片的基团在反应中从肽键中释放出来，从而形成丝-酪环二肽等产物。而这些变化的成分，主要集中在极性较大的亲水性部位，这就有利于炮甲片有效成分的煎出，就有可能是穿山甲炮制品增效的物质基础。

本实验基于飞行时间质谱联用技术所提供的高质量质谱数据，对穿山甲药材及其炮制品中的成分变化进行全面分析，为穿山甲炮制后变化的化学成分鉴定提供了一种高效、准确的的分析方法。同时为炮甲片的药效物质基础的深入研究提供了相关基础。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版一部[M]．北京：化学工业出版社，2010：251.

[2] 吴芝园，刘 逊.穿山甲现代临床应用浅谈[J].亚太传统医药，2016,12(4)：77-80.

[3] 王永生，张英华，张 洁，等.穿山甲及其炮制品的红外光谱鉴别[J]．长春中医学院学报，1990，6(4)：35．

[4] 王树春，张 丽，吴云山，等.药材穿山甲的X射线衍射Fourier谱分析鉴定[J]．药物分析杂志，2003增刊：19-22．

[5] 罗宪堂，钱 进，李 瑛，等．猪蹄甲与穿山甲片中化学元素和氨基酸的分析比较[J]．中医药学刊， 2002， 20(5)：604-605．

[6] 许重远，张 焜，李亦蕾，等．高效毛细管蛋白电泳法对鸡内金和穿山甲的鉴别[J]．解放军药学学报，2007，23(6)：464-466．

[7] 吴长虹.以蛋白质芯片为中药蛋白质/肚相互作用载体分析几种动物类中药的生物学特性[D]．长沙：湖南中医药大学，2009：5．

[8] 马雪梅，王 强，秦永祺，等．炮制前后穿山甲中环二肽成分的HPLC定量分析[J]．中草药，1990，21(9)：19-20．

[9] 崔小兵，单晨啸，文红梅，等．基于UFLC / Q -TOF-IS分析鼓炒白术的物质基础[J]．中国中药杂志，2013，38(12)：1929-1933．

[10] 何 庆，朱栋梁，张晓宇，等．不同类型烟叶中游离二肽的组成及含量差异分析[J]．中国烟草学报，2014，21(4)：1-6．

(收稿：2017-03-07)

TOF MS-IDA-MS/MS based analysis on material base of Manis pentadactyla stir fried with sand

Yuan Juanjuan，Liu Xun.

Kunshan Hospital of Traditional Chinese Medicine in Jiangsu Province(Kunshan 215300)

Objective：To conduct a preliminary research on the synergistic mechanism of pangolin scales. Methods：The components of pangolin scales were analyzed by TOF MS-IDA-MS/MS before and after processing. The target compounds were also analyzed using analysis software such as Markerview. The compounds were then screened and the chemical constituents detected by the relative molecular mass and MS2 were identified. Results：The results have shown that PCA analysis conducted was able to effectively distinguish the changes that occurred before and after processing pangolin scales. After undergoing processing, four (4) new components occurred.An increase on the level of Cyclo-(Ser-Tyr) and Cyclo-(Phe-Pro), two components already present in pangolin scales. Conclusion：The Hydrophilic substances present on the cyclo-dipeptide are increased after processing pangolin scales. Hydrophilic contents of cyclo-dipeptide are known to be an important material basis of synergism of pangolin scales.

Manis pentadactyla Processing TOF MS-IDA-MS/MS Component analysis

*江苏省苏州市科技发展计划项目(SYSD2013067)

穿山甲 炮制 TOF MS-IDA-MS/MS 成分分析

R684.3

A DOI 10.3969/j.issn.1000-7369.2017.06.058

△通讯作者