Panx1基因过表达对人肝癌Hep3B细胞增殖及迁移的影响

刘传亮，谭雪莹，史光军

(青岛大学医学院附属青岛市市立医院，山东青岛266000)

Panx1基因过表达对人肝癌Hep3B细胞增殖及迁移的影响

刘传亮，谭雪莹，史光军

(青岛大学医学院附属青岛市市立医院，山东青岛266000)

目的探讨Panx1基因过表达对人肝癌Hep3B细胞增殖及迁移的影响。方法构建Panx1过表达慢病毒质粒和过表达空载慢病毒质粒，包装生产慢病毒，分别转染Hep3B细胞(过表达组、对照组)。用Western blotting法检测Hep3B细胞Panx1、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)表达，CCK-8法检测细胞增殖能力(OD值)，划痕实验检测细胞迁移能力(相对迁移距离、划痕愈合率)。结果过表达组Panx1、E-cadherin蛋白相对表达量较对照组高(P均<0.05)，Vimentin蛋白相对表达量较对照组低(P<0.05)；各时间点(0 h除外)OD值较对照组低(P均<0.05);相对迁移距离较对照组低,划痕愈合率较对照组高(P均<0.05)。结论Panx1基因过表达可抑制Hep3B细胞增殖与迁移。

肝肿瘤；Panx1基因；Hep3B细胞；细胞增殖；细胞迁移

肝癌是癌症死亡的第三大原因，仅次于肺癌和胃癌[1,2]。该病起病隐匿，多数患者确诊时已发生转移，患者总体生存率低[3,4]。探讨与肿瘤转移相关的因素，寻找新的防治靶点，是临床面临的重要任务。Pannexin基因是近年发现的缝隙连接家族的新成员，主要有Panx1、Panx2、Panx3三种亚型[5]。Panx1的6个亚基形成1个六聚体，其主要功能是形成大孔单膜通道，该通道可由电压、细胞内高钙、细胞外高钾等刺激激活。Panx1通道在细胞通讯和信号传递过程中发挥调控作用[6,7]。研究表明，Panx1参与细胞增殖、细胞分化、炎症发生、脑缺血、癫痫和肿瘤等的发生发展[8～10]。2017年1～7月, 本研究构建Panx1过表达慢病毒质粒，用其转染人肝癌Hep3B细胞，观察Hep3B细胞增殖、迁移能力的变化，以探讨Panx1在肝癌细胞中的生物学作用。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂来源 人肝癌细胞株Hep3B、人胚肾细胞293T购自中国科学院上海细胞库；Opti-MEM、DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、PBS购自Gibico公司；CCK-8购自日本DoJINDO公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、RIPA裂解液购自中国碧云天生物技术研究所；青链双抗购自美国Hyclone公司；Panx1抗体、GAPDH抗体，HRP二抗购自Sigma公司；Panx1过表达质粒和过表达空载质粒、购自南通思特康生物科技有限公司；质粒DNA中抽试剂盒购自Invitrogen公司；慢病毒pCMV-dR8.91、pCMV-VSV-G包装质粒来源于本实验室。

1.2 慢病毒包装及Hep3B稳转株构建 病毒包装系统为三质粒系统，由pCMV-dR8.91、pCMV-VSVG、Panx1-OE/Panx1-OE-control组成。293T细胞融合度在80%～90%时，将三种质粒联合PEI转染至293T细胞，转染5 h后更换完全培养基，24 h后换液，48 h后收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，72 h后再次收集，5 000 r/min离心15 min，去除细胞碎片，离心后以0.45 μm滤器过滤，过滤后检测病毒滴度，分装于15 mL离心管中，置于-80 ℃冰箱保存。通过梯度实验来确定嘌呤霉素对Hep3B细胞的最佳致死药物浓度，将Hep3B细胞随机分为过表达组与对照组，分别转染Panx1-OE慢病毒和Panx1-OE-control，加入感染增强剂polybrene(终浓度5 μg/mL)，24 h后换液，48 h后加嘌呤霉素2 μL筛选(浓度10 mg/mL)，隔1 d换1次筛选培养基，筛选1周。慢病毒携带的Panx1基因即可获得稳定表达。

1.3 Hep3B细胞Panx1、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)表达检测 采用Western blotting法。Hep3B稳转细胞消化裂解，提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白总浓度，根据Panx1蛋白相对分子质量配制浓缩胶和分离胶，等胶凝固后，将其放入电泳槽中，加电泳液，取各组蛋白30 μg上样到10%胶，电泳结束后，使用转膜装置，100 V恒压条件下电转90 min，将蛋白转移到NC膜，于TBST配5%的脱脂牛奶常温下封闭1 h后，TBST洗膜3次，每次10 min，加入TBST稀释的一抗(anti Panx1 1∶500；anti GAPDH 1∶2 000；anti E-cadherin 1∶1 000；anti Vimentin 1∶1 000)，4 ℃孵育12 h，孵育完TBST洗膜3次，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000)室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。配制蛋白显影液上机检测。用Image Pro Plus 软件分析光密度(OD)值。

1.4 Hep3B细胞增殖能力检测 采用CCK-8实验。取两组细胞，分别制成1.5×104/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每组设6个复孔，每孔100 μL细胞悬液，铺六块板。继续培养0、24、48、72、96、120 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL置于37 ℃、5% CO2的培养箱继续培养2 h，用酶标仪测波长450 nm处OD值，每组去掉最大值和最小值，取平均值。

1.5 Hep3B细胞迁移能力检测 采用划痕实验。在六孔板后面用记号笔每孔标记5条横线，取两组细胞铺六孔板，第2天长满，用20 μL枪头剪平，每孔划3条垂直于后面的横线。PBS缓慢清洗3次，去除悬浮细胞，加入无血清培养基，显微镜下拍照，培养24 h后，再次拍照，记录两次拍照划痕的距离。用Image Pro Plus 软件处理分析。相对迁移距离=0 h划痕面积/高度-24 h面积/高度，划痕愈合率=(0 h划痕面积-24 h划痕面积)/0 h划痕面积×100%。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 Panx1基因过表达对Hep3B细胞Panx1、E-cadherin及Vimentin蛋白表达的影响 过表达组Panx1、E-cadherin及Vimentin蛋白相对表达量分别为1.28±0.17、0.83±0.22、0.08±0.01；对照组分别为0.56±0.13、0.26±0.04、0.48±0.16。两组Panx1、E-cadherin及Vimentin蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.2 Panx1基因过表达对Hep3B细胞增殖能力(OD值)的影响 培养0、24、48、72、96、120 h，过表达组OD值分别为0.201±0.003、0.235±0.006、0.282±0.005、0.359±0.012、0.479±0.005、0.601±0.013；对照组分别为0.199±0.002、0.249±0.002、0.337±0.007、0.479±0.009、0.678±0.004、0.890±0.006。两组各时间点(0 h除外)OD值比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.3 Panx1基因过表达对Hep3B细胞迁移能力的影响 过表达组相对迁移距离为0.59±0.09，划痕愈合率为15.01%±1.69%；对照组分别为0.98%±0.07%、27.11%±2.21%。两组相对迁移距离、划痕愈合率比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

3 讨论

转移是癌症患者预后差的主要因素。Panx1已被证实在多种肿瘤增殖和转移中发挥重要作用，在不同器官和组织，其发挥的功能不同，如Lai等[11]发现在Panx1缺陷型大鼠C6胶质瘤细胞中，过表达Panx1起到肿瘤抑制作用，但在人神经胶质瘤细胞系中内源表达则加速胶质瘤肿瘤聚集体形成。在转移进展期间，循环的癌细胞会滞留在末端血管内，大部分死于机械变形，Furlow等[12]研究表明，在高度转移性乳腺癌中，Panx1可通过增加膜通道的机械敏感性，使转移性细胞存活，使用Panx1通道抑制剂显著降低了乳腺癌转移的效率。这些数据表明在微血管系统诱导的生物力学创伤中Panx1可促进乳腺癌细胞的转移。Li等[13]发现沉默Panx1可抑制U87MG细胞的增殖。Schalper等[14]报道Panx1在胆囊腺癌和胆囊组织中表达不同，在胆囊腺癌中表达较低，使用Ki67和Panx1免疫染色，发现Panx1表达与胆囊癌增殖呈负相关。但Panx1对肝癌细胞增殖及迁移的作用目前尚未报道。本实验前期研究发现Panx1在肝癌和肝正常组织表达有显著差异，在肝癌中表达高于癌旁组织。提示Panx1可能发挥癌基因的作用。

为进一步探讨Panx1与肝癌细胞增殖和转移的关系，本研究构建了Panx1过表达慢病毒质粒和慢病毒空载质粒，慢病毒是以人类免疫缺陷1型病毒为缺陷发展的基因治疗载体，能将外源基因有效的整合到宿主染色体上，从而达到持久稳定的表达，对感染细胞和非感染细胞均具有感染能力。慢病毒包装由慢病毒表达载体和慢病毒包装载体组成，本研究应用慢病毒原理，在脂质体介导下将慢病毒质粒转染至293T细胞，收集病毒液感染Hep3B细胞，构建了Hep3B稳转细胞株，能长久过表达Panx1基因。研究证实，EMT是肿瘤转移的必要步骤，其过程涉及细胞表型的变化，E-cadherin和Vimentin是关键的标志物，Vimentin蛋白与肿瘤增殖和转移呈正相关，E-cadherin蛋白与肿瘤生殖转移呈负相关。Western blotting检测蛋白(Panx1,E-cadherin,Vimentin)的表达，发现Hep3B细胞中三种蛋白表达具有显著差异，相对于对照组，过表达组Panx1蛋白表达效率高，vimentin蛋白表达量显著降低，E-cadherin蛋白表达显著增高，差异均有统计学意义，提示Panx1可能有抑制细胞转移的功能。

为求进一步验证其在细胞迁移中的作用，进行划痕实验，划痕结果显示，与对照组相比，过表达组细胞迁移能力减弱，说明Panx1基因过表达后抑制了肿瘤的迁移。CCK-8结果表明，与对照组相比， Panx1过表达明显抑制了Hep3B细胞的增殖活力。提示Panx1对人肝癌Hep3B细胞增殖和迁移均有抑制作用。

综上，Panx1可能与肝癌细胞的增殖和迁移密切相关，其在肝癌的发生发展中可能起到抑制作用，Panx1有望成为肝癌的治疗靶分子。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.33.011

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史光军(E-mail:sgjzp@hotmail.com)

2017-07-07)