重组人脑钠尿肽对心力衰竭大鼠心肌重构及缝隙链接蛋白43 表达的影响

谭文婷，彭葳锐，唐芬，刘盛权，龙俊蓉，褚春

(1南华大学附属第一医院，湖南衡阳 421001；2南华大学附属第二医院)

重组人脑钠尿肽对心力衰竭大鼠心肌重构及缝隙链接蛋白43 表达的影响

谭文婷1，彭葳锐1，唐芬1，刘盛权1，龙俊蓉1，褚春2

(1南华大学附属第一医院，湖南衡阳 421001；2南华大学附属第二医院)

目的探讨重组人脑钠尿肽(rhBNP)对压力超负荷所致心力衰竭大鼠心肌重构及缝隙链接蛋白43(Cx43)表达的影响。方法将45只雄性SD大鼠随机分为心力衰竭(F)组、心力衰竭+ rhBNP(B)组、假手术(SO)组各15只，F组、B组经腹主动脉缩窄法建立压力超负荷心力衰竭大鼠模型，SO组大鼠不缩窄腹主动脉。B组经腹腔皮下注射用生理盐水配制的rhBNP 25 μg/(kg·d)，SO组和F组仅用生理盐水腹腔皮下注射，均给药8周。检测各组左心功能、血流动力学、QT离散度、左室心肌组织病理形态、心肌纤维化沉积和心肌Cx43的表达。结果与SO组比较，F组左心功能、血流动力学、QT离散度、左室心肌组织病理形态、心肌纤维化沉积和心肌Cx43表达均有统计学差异(P均<0.05)，显示心力衰竭模型制作成功。与F组比较，B组大鼠平均动脉压下降、QT离散度减小、心肌细胞排列紊乱程度减轻、心肌细胞间胶原纤维沉积减少、Cx43表达增加(P均<0.05)。结论rhBNP可改善压力超负荷下心力衰竭大鼠的血流动力学指标，上调心肌组织Cx43表达并抑制心肌重构。

心力衰竭；重组人脑利钠肽；缝隙连接；链接蛋白43；心肌重构

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of recombinant human brain natriuretic peptide (rhBNP) on the myocardial remodeling and connexin 43 (Cx43) expression of rats with cardiac failure caused by pressure overload.MethodsForty-five male SD rats were randomly divided into the heart failure group (group F), heart failure+rhBNP group (group B), and sham operation group (group SO) with 15 rats in each group. In the group F and group B, we established the rat models of pressure overload-induced heart failure by abdominal aortic constriction, while in the SO group, rats did not receive coarctation of the abdominal aorta. Rats in the group B were subcutaneously injected with rhBNP (25 ug/kg/d), while rats in the group SO and group F were injected intraperitoneally with normal saline for 8 weeks. The left ventricular function, hemodynamics, QT dispersion, left ventricular myocardial pathology, myocardial fibrosis and collagen deposition, and myocardial Cx43 protein expression were detected in each group.ResultsCompared with the SO group, the left ventricular function, hemodynamics, QT dispersion, left ventricular myocardial histopathology, myocardial fibrosis deposition, myocardial Cx43 protein expression were statistically significant in the group F (allP<0.05), which showed that heart failure model was established successfully. Compared with group F, the heart function of rats increased, the mean arterial pressure and QT dispersion decreased, the disordered arrangement of myocardial cells reduced, collagen deposition decreased between cardiac myocytes, and the expression of Cx43 increased in the group B (allP<0.05).ConclusionrhBNP can improve the cardiac function and hemodynamic indexes in rats with heart failure under pressure overload, up-regulate the myocardial expression of Cx43 protein, and inhibit myocardial remodeling.

Keywords: heart failure; recombinant human brain natriuretic peptide; gap junction; connexin 43; myocardial remodeling

脑利钠肽是心力衰竭诊断、疗效评估及预后判断的一项有效指标。但是，关于脑利钠肽对心力衰竭时的缝隙连接以及心肌重构的作用及其机制尚不明确。缝隙连接是心肌细胞之间一种电化学偶联的通道，其与心室重构有着密切的关系，其基本构成单位是缝隙连接蛋白(Cx)，而Cx43则是心肌工作细胞中最主要的连接蛋白。心肌重构是心力衰竭发生和发展的重要环节[1]，心力衰竭时所出现的电生理紊乱可产生心律失常，从而导致离子通道重构和缝隙连接重构。近期有研究发现在出现心力衰竭的情况下，心肌会出现缝隙连接重构，Cx43于心力衰竭早期可增加，而晚期则明显减少并伴有分布异常[2，3]。2011年6月～2016年12月，我们通过建立压力超负荷心力衰竭大鼠模型，观察重组人脑钠尿肽(rhBNP)对心肌重构和Cx43表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料 雄性SD大鼠45只，体质量(200±20)g，购于南华大学动物实验中心。Masson染色试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司；HE染色试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；兔抗大鼠Cx43一抗、羊抗兔二抗、免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司；冻干rhBNP(0. 5 mg/支)购于西藏诺迪康药业股份有限公司。

1.2 动物分组及模型制备 将45只SD大鼠随机分为心力衰竭组(F组)、心力衰竭+ rhBNP(B组)和假手术组(SO组)，每组15只。F组和B组大鼠均经腹腔注射戊巴比妥钠35 mg/kg麻醉，在无菌的环境下，于腹主动脉处将一外径为0. 6 mm的钢针与腹主动脉一并结扎，取出钢针，从而建立腹主动脉缩窄心力衰竭模型。术后8周后采用心脏彩超仪和12 MHz探头检查射血分数(EF)，连续取三个心动周期计算EF平均值，EF小于50%的动物进入本次实验研究。SO组大鼠除不缩窄腹主动脉外，其余步骤与上述两组相同。B组经腹腔皮下注射用生理盐水配制的rhBNP 25 μg/(kg·d)，SO组和F组则用生理盐水腹腔皮下注射，均给药8周。

1.3 血流动力学和QT离散度测定 每组大鼠均经腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，分离右侧颈总动脉，插入已预先充满肝素生理盐水的PE50导管，使用BL-420生物机能实验系统记录大鼠颈动脉平均动脉压(MABP)。同时以16导生理记录仪连续测量5个QT间期平均值，计算QT离散度。

1.4 心肌组织形态结构观察 取各组左心室前壁组织，10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，HE染色，最后树胶封片，观察形态结构变化。

1.5 心肌纤维化沉积检测 取各组左心室前壁组织，bonius氏液固定2 h，流水冲洗直至无黄染，室温晾干，严格按照说明书步骤进行Masson染色。于400倍镜下选取不同视野，使用Image-Pro Plus 6.0软件测量计算出观察到的染色区域胶原纤维染色面积，每个标本各取5个视野，测量并计算平均值。

1.6 Cx43表达检测 采用免疫组化法。各组石蜡切片脱蜡水化，于3% H202中室温孵育；冲洗、冷却、孵育；再冲洗、脱水、透明、封片。使用Image-Pro Plus 6.0软件计算出染色区域的总光密度值和染色面积，总光密度值和染色面积的比值为Cx43表达平均光密度值(MOD)；每个标本各取5个视野，测量并计算平均值。

2 结果

2.1 三组EF、MABP比较 SO组、F组、B组EF分别为(74±5)%、(40±6)%、(41±7)%，三组EF比较差异有统计学意义(P<0.05)。与SO组比较，F组与B组大鼠EF均下降 (P均<0.05)；B组与F组比较，EF差异无统计学意义(P>0.05)。SO组、F组、B组MABP分别为(87.58±5.81)、(128.5±6.315)、 (100. 2±14. 27)mmHg,三组MABP比较差异有统计学意义(P<0. 05)；与SO组比较，F组与B组大鼠MABP均升高 (P均<0.05)；B组大鼠MABP低于F组 (P<0.05)。

2.2 三组QT离散度比较 SO组、F组、B组QT离散度分别为 (25.43±3.56)、 (128. 5±6.315)、(26. 05±4.11) ms，三组QT离散度比较差异有统计学意义(P<0.05)。与 SO组比较，F组大鼠 QT离散度增加(P<0.05)；与 F 组相比，B 组QT离散度减少(P<0.05)。

2.3 三组心肌组织形态结构及纤维化沉积情况 HE染色显示，SO组心肌细胞形态正常，结构清晰；F组左心室前壁心肌细胞肥大，排列紊乱，B组心肌细胞直径较F组减小，心肌组织结构紊乱改善。Masson染色镜下胶原纤维染呈蓝色。SO组、F组、B组心肌纤维沉积面积分别为(12 125±3 420)、(14 010±6 120)、(126 320±48 612)μm2，三组心肌纤维沉积面积比较差异有统计学意义(P<0. 05)；F组大鼠心肌组织间质纤维沉积较SO组增加(P<0.05)，B组大鼠心肌组织纤维沉积较F组减少(P<0.05)。

2.4 三组左室心肌Cx43表达 SO组、F组、B组心肌Cx43表达MOD分别为74.32±4.28、51.26±6.36、69.84±3.24，三组心肌Cx43表达MOD比较差异有统计学意义(P<0. 05)。与SO组比较，F组Cx43表达减少(P<0.05)，经rhBNP的治疗后，B组较F组Cx43表达增加(P<0.05)。

3 讨论

心肌重构是心力衰竭的重要环节，可最终引起心律失常和猝死[4]。本研究发现心力衰竭模型大鼠心脏左心EF值明显下降，血压升高。同时，大鼠心肌细胞肥大，排列紊乱，大量纤维沉积于心肌组织间质，引起心肌重构和心肌顺应性下降[5]，心脏最终出现舒张功能和收缩功能失调，从而发生心律失常[6]。同时，心肌重构也可导致心肌电生理重构和电生理失稳态。QT离散度被认为是心室复极异质性较为准确的量化指标[7]，与充血性心力衰竭、室性心律失常、心肌缺血、心肌肥厚等疾病有着密切关系[8]。有报道显示QT离散度增加越多，心肌电生理失稳态就越严重，也就越容易导致心律失常的发生[9]。本研究发现，心力衰竭的大鼠QT离散度明显增加，这预示其更容易导致心律失常。

缝隙连接是一种细胞间连接，它由许多Cx组成并构成心肌细胞间电兴奋传导的关键部位，为相邻细胞提供了一个低阻抗的电藕联通道。研究发现，诱导敲除成年小鼠心脏中的Cx43,可以减慢心室传导甚至猝死[9]。同时有结果表明通过刺激迷走神经调节Cx43可抑制致死性心律失常的发生，从而降低心功能不全小鼠的病死率[10]。因此心肌电生理重构、心律失常与Cx43都有着密切的关系。Beardless等[11]发现，心肌组织缺血可造成Cx43减少，从而影响细胞间的电藕联，引起心律失常。本研究发现，心力衰竭的大鼠心肌细胞间质纤维化沉积面积明显增加，而心肌组织Cx43表达减少，提示心力衰竭大鼠心肌组织存在明显缝隙连接重构，并可能与心力衰竭大鼠QT离散度增加以及电生理失稳态有关。

脑利钠肽主要是由左心室的心肌细胞所分泌的一种肽类激素。有研究表明脑钠肽具有抑制RASS系统活性、抑制促肾上腺皮质激素的释放、促进排钠利尿等作用[12，13]。本研究显示rhBNP可降低MABP，证实其有利尿降压作用。Su等[14]发现脑利钠肽还可改善心肌梗死后大鼠心肌纤维化，Zhu等[15]也发现长期脑利钠肽干预可改善心力衰竭大鼠的心肌重构。本研究发现，经rhBNP干预后心力衰竭大鼠心肌重构明显改善，心肌纤维化沉积面积明显减少。同时发现rhBNP干预后心力衰竭大鼠心肌组织Cx43蛋白表达上调，提示rhBNP可以改善心力衰竭大鼠心肌的缝隙连接。与此同时，rhBNP干预后心力衰竭大鼠QT离散度也明显减少，说明rhBNP可能在治疗心力衰竭的同时还可以改善心力衰竭时的心肌电生理失稳态，有助于减少心律失常的发生。本研究发现，心力衰竭大鼠出现缝隙连接重构，Cx43表达减少及分布紊乱。经rhBNP治疗8周后缝隙连接重构得到抑制，电生理失稳态改善。

综上所述，rhBNP具备潜在抑制心律失常发生的作用，作为一种新型的抗心衰药物临床应用前景广阔。但是，rhBNP干预心力衰竭时心肌电生理失稳态和缝隙连接重构作用的更深层机制仍不是十分清楚，有待进一步研究。

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Effects of recombinant human brain natriuretic peptide on myocardial remodeling and connexin 43 expression in rats with heart failure

TANWenting1,PENGWeirui,TANGFen,LIUShengquan,LONGJunrong,CHUChun

(1TheFirstAffiliatedHospitalofSouthChinaUniversity,Hengyang421001,China)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.33.003

R541.6

A

1002-266X(2017)33-0009-04

国家自然科学基金资助项目(81202830)。

谭文婷(1993-)，女，在读硕士，研究方向为心血管疾病的诊治。E-mail：15377389133@163.com

褚春(1977-)，女，副主任药师，研究方向为药物联合基因修饰对心肌梗死后心肌重构的作用及机制。E-mail：yjchuchun@163.com

2016-12-31)