水稻叶片内卷突变体rl(t)的鉴定与基因定位

韩保林陶宇张洪凯 顾朝剑 廖泳祥 彭永彬 张红宇 徐培洲 陈晓琼 吴先军

水稻叶片内卷突变体rl(t)的鉴定与基因定位

韩保林#陶宇#张洪凯 顾朝剑 廖泳祥 彭永彬 张红宇 徐培洲 陈晓琼 吴先军*

(四川农业大学 水稻研究所/西南作物基因资源与遗传改良教育部重点实验室, 成都611130；#共同第一作者;*通讯联系人, E-mail:wuxjsau@126.com)

【目的】叶片是水稻理想株型的重要内容，叶片适度卷曲可以提高光合效率。对卷叶相关基因进行遗传分析和初步定位，为下一步的基因克隆与功能分析提供研究基础。【方法】利用EMS诱变雄性不育保持系宜香1B获得一份稳定遗传的叶片向内卷曲突变体，暂命名为rl(t)。在成熟期，测定野生型和rl(t) 的主要农艺性状；在分蘖期，取野生型和rl(t) 叶片用FAA固定液固定进行石蜡切片，同时，用野生型和rl(t)剑叶测定叶绿素含量；在抽穗期，利用Li-6400便携式光合仪测定10株抽穗期的野生型和rl(t)的光合参数；将rl(t)与野生型及日本晴杂交，观察 F1植株表型，对F2表型分离进行χ2测验，对突变体进行遗传分析。以 rl(t)/日本晴的 F2群体为材料，利用 BSA 法进行定位。【结果】与野生型相比，突变体叶片向内卷曲明显，叶片更加直立，叶色变深，其他主要农艺性状均有不同程度降低。光合特性分析表明，突变体比野生型具有更高的光合色素含量，但光合效率没有明显差异。叶片组织切片观察表明，突变体中泡状细胞变小可能是导致叶片卷曲的主要原因。遗传分析表明，该突变体受一对隐性核基因控制，利用突变体与日本晴的F2群体进行基因定位，最终将该基因定位在第7染色体长臂InDel标记Ind3和Ind4间610 kb的物理区间。【结论】rl(t)叶片内卷是由于近轴面泡状细胞面积减小。RL(t)定位区间内未见卷叶相关基因报道，推测RL(t)可能是一对新基因。

水稻；卷叶；基因定位

叶片是水稻的主要光合器官，同时也是是水稻理想株型的重要构成因素，与水稻产量密切相关[1]。育种家提出的多个水稻理想株型模式中都将叶片适度内卷作为重要的特征之一，并据此选育出一系列的高产超级稻品种[2]。叶片适度卷曲，能够使叶片直立，大田种植中能有效增加群体的透光性。充分发掘和研究叶形基因对构建水稻理想株型和解析水稻叶形分子机制具有重要意义。

截至目前，科学家通过各种物理和化学方法获得了大量的叶形材料，并定位和克隆了部分叶片卷曲基因。包括 rl1、rl2、rl3、rl4、rl5、rl6[3]、rl7[4]、rl9(t)[5]、rl10(t)[6]、rl11(t)[7]、url1(t)[8]、nal3[9]、rl12(t)[10]、rl(t)[11]、rl14[12]、rl15(t)[13]、rl16(t)[14]等。随着分子生物学的发展，一些叶形基因的研究得以深入。ADL1[15]编码半胱氨酸蛋白酶，基因突变导致叶片近-远轴极性改变从而导致叶片向外卷曲。OsAGO7[16]和OsAGO1a[17]属于Argonaute(AGO)基因家族，OsAGO7的功能获得性T-DNA插入突变体和抑制OsAGO1a表达的转基因植株，叶片都表现为外卷。ROC5[18]编码一个具有亮氨酸拉链结构的转录因子，负调控泡状细胞的发育，功能缺失突变体泡状细胞大小和数量都增加，从而导致叶片外卷。此外，ACL1[19]编码一个无保守结构域的功能未知蛋白，SRL1[20]编码糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，RL14[12]编码一个2OG-Fe（Ⅱ）氧化酶，OsCOW1/NAL7[21]属于水稻YUCCA 基因家族,NRL1[22]编码糖基转移酶家族的纤维素合酶类似蛋白。这些基因突变导致叶片卷曲都是由于泡状细胞数量和/或大小的改变。SLL1[23]编码一个KANADI 类转录因子，基因突变后导致远轴面厚壁组织细胞程序化死亡，从而导致突变体叶片向内卷曲，新近报道的SRL2[24]编码一个新的植物特异蛋白，叶片向内卷曲也是由于远轴面厚壁组织细胞的缺失，双突和定量分析表明SLL1和SRL2处于不同的遗传通路。CFL1[25]编码一个WW 结构域蛋白，基因突变导致叶片角质层发育受损从而内卷。挖掘和鉴定新的叶形基因对深入解析叶形分子机制具有重要意义。

本研究利用EMS诱变雄性不育保持系材料宜香1B筛选获得一份叶片向内卷曲、叶色加深、叶片直立突变体rl(t)，并调查了突变体的表型和主要农艺性状，测定了突变体的光合作用和光合色素含量，通过石蜡切片分析了突变体的叶片组织结构，对突变体进行了遗传分析和基因定位，以期为进一步研究叶形分子机制提供参考。

1 材料与方法

1.1试验材料

本实验室利用EMS诱变宜香1B，在M2获得一份叶片向内卷曲突变体，暂命名为rl(t)，经多代种植突变性状稳定。

1.2遗传分析和定位群体的构建

2014年夏在四川温江以rl(t)为母本，宜香1B和日本晴分别为父本杂交,获得杂种F1；2014年冬在海南陵水，种植F1，F1自交，成熟后按单株收获全部种子；2015年夏在四川温江种植rl(t)/宜香1B、rl(t)/ 日本晴的F2群体，成熟期调查rl(t)/宜香1B群体中平展叶片和向内卷曲叶片单株数进行遗传分析，选取rl(t)/ 日本晴群体中与突变体rl(t)叶片形态一致的单株用于基因定位。同时，宜香1B和突变体rl(t)作为对照种植。

1.3农艺性状调查

2015年在四川温江分别种植rl(t)和宜香1B，田间栽插规格为15 cm×21 cm，每行10株，常规田间管理，成熟期随机调查10株的分蘖数、株高、结实率和千粒重等农艺性状。

成熟期分别测定突变体与野生型的叶卷曲指数(LRI，%)与叶直立指数（LEI，%）[16]，计算公式为LRI=(Lw-Ln)/Lw×100； LEI=Lnl/Lsl×100。其中Ln为自然状态下叶片最宽处两边缘之间的距离，Lw为叶片展开后两边缘间的距离；Lnl为自然状态下叶片基部到叶片尖端的距离，Lsl为叶片拉伸后叶片基部到叶片尖端的距离。

1.4叶片组织切片观察

参照邹良平等[18]的方法进行。分蘖盛期分别取rl(t)和宜香1B剑叶中间部位用FAA固定液固定，经梯度酒精脱水,二甲苯透明，浸蜡和包埋后切片，厚度为10 pm，用甲苯胺蓝染色，最后在显微镜下观察拍照。

1.5光合色素及光合参数的测定

参照Lichtenthaler的方法[26]，分蘖盛期分别取rl(t)和宜香1B剑叶，去除主脉剪碎，各称取0.20 g，浸泡在30 mL 体积分数为80%的丙酮溶液中，24℃黑暗条件下放置48 h，10 000 r/min下离心10 min，用紫外分光光度计分别在663 nm、646 nm和470 nm 3个波长下测定rl(t)和宜香1B的光密度值，每个样品重复3次。

表1 基因定位分子标记引物及qRT-PCR引物序列Table 1. The sequences of molecular markers used for gene mapping and qRT-PCR markers.

大田条件下，利用Li-6400便携式光合仪(LI-COR, 美国)分别测定10株抽穗期的rl(t)和野生型叶片的净光合速率、气孔导度、CO2胞间浓度和蒸腾速率。

1.6DNA提取和基因定位

采用CTAB法[27]提取基因组DNA，选取平展叶片单株和叶片内卷单株各15株，提取DNA分别构建DNA显、隐池。利用均匀分布于水稻12条染色体上的500对SSR及InDel标记筛选rl(t)和日本晴间多态性标记，用多态性标记进行F2显、隐池分析，找到连锁标记，再用单株进行验证。在初定位的基础上，利用已经公布的93-11和日本晴基因组序列，运用 Primer 5.0软件设计InDel引物（表1）缩小定位区间。

1.7卷叶相关基因的实时PCR分析

抽穗期分别取野生型与突变体剑叶，采用Trizol试剂提取总RNA, 使用逆转录试剂盒HiScript Q RT SuperMix for qPCR，将总RNA纯化反转成cDNA。 对RL14、ACL1、NAL7、NRL1、SRL1、ROC5、OsAGO7、SLL1、SRL2及CFL1等与叶片卷曲相关基因进行定量分析。引物设计见表1。以Actin为内参, 50 µL PCR体系, 设置3次重复,具体操作参照Vazyme公司SYBR Green Master Mix说明书，反应在Bio-Rad CYF96型定量PCR仪上进行。

2 结果与分析

2.1突变体表型分析

突变体rl(t)与野生型最显著差异表现在叶片上，野生型叶片近乎平展，叶色淡绿，而rl(t)叶片向内卷曲严重，且叶色深绿（图1-A、B）。rl(t)在3叶期时叶片开始向内卷曲，随着生长，内卷逐渐明显。突变体剑叶、倒2叶和倒3叶的卷曲指数分别为64.85%、67.42%、71.80%，远高于野生型（图1-C）。突变体叶片更加直立，与野生型相比，rl(t)剑叶、倒2叶和倒3叶的叶片直立指数均显著增加。除叶片外，突变体与野生型在生育期、株高、分蘖数、穗长、每穗实粒数、每穗粒数、结实率、粒长及千粒重等性状方面均存在极显著差异（表2）。

2.2光合作用与光合色素含量测定

在分蘖期分别测定野生型和突变体剑叶的光合色素含量，结果表明，rl(t)的叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量均极显著增加，类胡萝卜素显著增加（图2）。

同时，测定野生型和突变体光合参数。rl(t)的净光合速率、气孔导度及蒸腾速率都低于野生型，而胞间二氧化碳浓度则高于野生型，但所有差异都未达到显著水平（表3）。

2.3叶片形态的组织学分析

为从组织层面解析rl(t)叶片卷曲原因，抽穗期取野生型和突变体叶片固定进行石蜡切片。结果显示，在叶片卷曲处，野生型泡状细胞大小为2904.45 μm2, rl(t)为1126.3 μm2，突变体的泡状细胞面积明显减小，而其他部位未发现明显异常（图3）。表明可能是泡状细胞面积减小导致了叶片向内卷曲。

图1 野生型宜香1B与突变体rl(t)的表型特征Fig.1. Phenotype of wild type Yixiang 1B and mutant rl(t).

表2 宜香1B与rl(t)的农艺性状比较Table 2. Comparison of agronomic traits between rl(t) and its wild type.

2.4遗传分析与基因定位

rl(t)/宜香B和rl(t)/日本晴的F1叶片均呈平展，rl(t)/宜香1B的F2群体遗传分析发现，F2群体叶片呈现分离，在总共200个单株中，157个单株表现为叶片平展，43个单株表现为叶片向内卷曲，经χ2测验, 平展叶∶卷叶符合3∶1的分离比(χ2= 1.31)，此外，rl(t)/日本晴的F2群体展叶与卷叶单株数分别为1905和579个单株，同样符合3∶1分离比(χ2=3.79)，综合结果表明叶片卷曲由一对隐性单基因控制。

图2 野生型宜香1B与突变体rl(t)光合色素比较Fig.2. Comparison of leaf photosynthetic pigment contents between Yixiang 1B and rl(t).

图3 野生型宜香1B与突变体rl(t)的叶片细胞学分析Fig.3. Cytology analysis of Yixiang 1B(WT) and the rl(t) mutant at the heading stage.

图4 RL(t)的基因定位Fig. 4. Molecular mapping of RL(t).

表3 野生型宜香1B与突变体rl(t)光合特性比较Table 3. Comparison of the photosynthetic characters between Yixiang 1B and rl(t).

以rl(t)/日本晴的F2群体为定位群体，利用在双亲间表现多态性的428对引物，通过集团分离分析法进行基因定位（图4），发现在第7染色体长臂上的标记RM3394与RM5752在基因池间表现连锁。然后利用579个隐性单株进行验证和初步定位，结果将RL(t)定位在RM3394与RM5725之间，遗传距离分别为3.37 cM和2.76 cM。

为进一步精细定位，在RM3394与RM5725之间共设计了9对插入缺失（Ind）标记, 其中6对表现多态性(表1) 。利用多态性标记对579个隐性单株进行连锁分析，最终将RL(t)定位在Ind3与Ind4之间，遗传距离分别为0.95 cM和0.69 cM，根据已公布的9311参考序列，两者物理距离为610 kb。在水稻MSU-RGAP数据库（http：//rice. plantbiology.msu.edu/index.shtml）查询，在该定位区间内共有102个基因，没有与叶形相关基因。

图5 卷叶相关基因在野生型宜香1B与突变体rl(t)叶片中的实时PCR分析Fig. 5. Real-time PCR analysis of the genes related to rolled leaf in leaves of Yixiang 1B and rl(t).

2.5卷叶相关基因的实时PCR分析

为了研究rl(t)与其他已经报道卷叶基因的关系，我们对与叶片卷曲相关的10个基因进行了实时PCR分析。结果发现，与泡状细胞发育相关基因ACL1、RL14、NAL7、NRL1、SRL1表达量下调，ROC5表达量则出现上调，与叶片极性发育相关的OsAGO7、SLL1、SRL2及与角质层相关基因CFL1的表达量无明显变化（图5），暗示rl(t)可能与ACL1、RL14、NAL7、NRL1、SRL1及ROC5处于同一调控通路，通过调控泡状细胞的发育影响叶片的卷曲。

3 讨论

叶片卷曲是水稻叶形特征之一。目前水稻中发现了丰富的水稻叶卷材料，根据叶片卷曲方向可分为内卷和外卷，根据卷曲程度可分为高度筒卷、中度卷曲和微卷，根据卷曲发生的时期可分为全生育期卷曲、生育前期卷曲而后期展开和前期不卷而后期卷曲。本研究中rl(t)属于内卷，高度筒卷且表现为全生育期卷曲。除了叶形上的变化，rl(t)叶片颜色加深，实验数据表明，rl(t)叶片叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素及类胡萝卜素含量均极显著或显著高于野生型，但rl(t)的光合效率与野生型无明显改变，推测与叶片向内卷严重、光合面积减少相关，这与赵芳明[28]等研究结果一致。

水稻中已经定位克隆多个控制叶片卷曲的基因，通过分析发现，影响叶片卷曲的形成机制，可以分为四类:第一类，近-远轴极性的改变导致叶片卷曲，例如SLL1[24]、ADL1[15]、OsAGO7[16]、OsAGO1a[17]等；第二类，泡状细胞异常导致叶片卷曲，例如ROC5[18]、ACL1[19]等；第三类，厚壁组织发育异常导致叶片卷曲，例如SLL1[24]、SRL2[25]；第四类，角质层发育异常导致叶片卷曲，例如CFL1[26]。其中，泡状细胞异常导致叶片卷曲是报道最多的一类。泡状细胞是水稻的动力细胞，在水分储藏、调控叶片的伸展和卷曲上起着重要作用[29]。泡状细胞导致叶片卷曲，主要是通过影响泡状细胞的数量和/或大小。SRL1[20]、LC2[30]、OsHox32[31]和YABBY1[32]等通过调控泡状细胞数量控制叶片的卷曲，RL14[12]、OsMYB103L[33]和NRL1[23]等通过影响泡状细胞的大小调控叶片卷曲，而ROC5[18]、ACL1[19]、NAL7[22]等则是同时作用于泡状细胞的数量和大小调控叶片卷曲。本研究中，石蜡切片观察发现，rl(t)的泡状细胞面积较野生型明显增加，而细胞数量几乎没有变化，表明泡状细胞面积的增加是导致rl(t)卷曲的主要原因。同时，定量PCR分析表明，rl(t)主要影响与泡状细胞相关基因的表达，推测rl(t)可能参与调控水稻叶片泡状细胞的发育。

本研究将RL(t)定位在第7染色体长臂两个InDel标记Ind3和Ind4之间，物理距离为610 kb。已报道的SRL1[20]也位于第7染色体，但与RL(t)不在同一区间，且物理位置较远。在定位区间内未见叶形相关基因报道，推测RL(t)可能是一个控制水稻叶片卷曲的新基因。

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Identification and Gene Mapping of a Rolled Leaf Mutant rl(t) in Rice

HAN Baolin#, TAO Yu#, ZHANG Hongkai, GU Chaojian, LIAO Yongxiang, PENG Yongbin, ZHANG Hongyu, XU Peizhou, CHEN Xiaoqiong, WU Xianjun*
(Rice Research Institute, Sichuan Agricultural University/Key Laboratory of Southwest Crop Genetic Resource and Improvement, Ministry of Education, Chengdu 611130, China;#These authors contributed equally to this work;*Corresponding author, E-mail: Wuxjsau@126.com)

【Objective】Rice leaf is an important factor for ideal plant architecture in rice, and moderate rolling of the leaves can improve light acceptance and photosynthetic rate. Genetic analysis and primary mapping of the target genes are useful in map-based cloning and function analysis.【Method】A stable inherited mutant, derived from an indica maintainer line Yixiang 1B by EMS treatment, exhibited significantly inward-rolling, more erect and green leaves. At the maturity stage, 10 plants of rl(t) and its wild type(WT) were randomly selected to measure the main agronomic traits including leaf rolling index and leaf erect index. At the tillering stage, the same part of leaf of rl16(t) and WT was taken and fixed by FAA for paraffin sectioning. The chlorophyll content in rl16(t) and WT was tested at the same stage. At the heading stage, the photosynthetic rate, intercellular carbon dioxide concentration, stamatal conductance，and transpiration rate of flag leaves in rl15(t) and WT were measured by using the portable gas exchange system Li-6400.【Result】Compared to wide type, rl(t) displayed reduced plant height, shortened panicle length as well as other agronomic traits. Leaf photosynthetic pigment contents were significantly higher than those of the wild type. However, no difference is observed in photosynthetic efficiency. Cytological analysis showed that the rolled leaf phenotype was possibly caused by the reduced size of bulliform cells. Genetic analysis indicated that rolled leaf phenotype in rl(t) was controlled by a single recessive nuclear gene. In an F2population derived from a cross between the mutant and Nipponbare, RL(t) was mapped to a 610 kb region between Ind3 and Ind4 on the long arm of chromosome 7. In target region, there are 102 genes altogether.【Conclusion】The rolled leaf of rl(t) was due to increased area of bulliform cells in adaxial layer and no gene related to roll-leaf was reported in the target region. So, RL (t) gene would be a putative novel rolled leaf gene.

rice; rolled leaf; gene mapping

Q343.5; S511.024

A

:1001-7216(2017)02-0149-08

2016-10-20； 修改稿收到日期:2016-12-29。

国家重点研发计划资助项目(2016YFD0100406)；农业部公益性行业(农业)科研专项(201403002-3)；四川省农作物育种攻关项目。