水稻耐盐基因定位与克隆及品种耐盐性分子标记辅助选择改良研究进展

井文章文华

综述

水稻耐盐基因定位与克隆及品种耐盐性分子标记辅助选择改良研究进展

井文*章文华

(南京农业大学, 南京 210095;*通讯联系人, E-mail： jingwen@njau.edu.cn)

土壤盐渍化严重制约水稻生产发展，提高耐盐性已成为水稻育种的重要目标之一。挖掘水稻耐盐新基因，解析其分子作用机制可以为水稻耐盐性遗传改良奠定基础。本文从定位群体、耐盐性鉴定时期和鉴定方法、耐盐性评价指标、鉴定到的耐盐QTL、耐盐QTL的精细定位和图位克隆等方面，总结了近年来水稻耐盐QTL定位研究中所取得的进展；介绍了水稻耐盐/盐敏感突变体筛选和基因克隆以及耐盐性关联分析的研究近况；并对水稻耐盐性分子标记辅助选择改良的现状作了概述。

水稻；耐盐性；基因定位；基因克隆；分子标记辅助选择；品种改良

土壤盐渍化是制约世界范围内水稻生产发展的主要因素之一。一方面，有较大面积的盐碱土无法用于水稻种植；另一方面，不合理的水资源管理引起的土壤次生盐渍化现象在水稻生产地区日益严重。通过遗传改良来提高水稻耐盐能力是进一步提高水稻种植面积和产量的有效途径之一。由于水稻耐盐性是多种耐盐生理生化反应的综合表现，是由多个基因控制的数量性状，遗传基础复杂[1]，采用传统育种方法改良水稻耐盐性的难度较大，进展缓慢。利用分子标记辅助选择(marker assisted selection, MAS)和基因工程技术可以加快水稻耐盐品种培育的进程，但单个基因或相关的少数几个基因的导入很难获得能够在大田生产中利用的耐盐品种。目前比较一致的观点是，培育有应用价值的耐盐水稻品种可能需要同时导入多个关键基因，对其耐盐调控网络中的多条途径进行遗传改良[2]。因此，鉴定水稻耐盐主效数量性状位点(quantitative trait loci, QTL）、克隆耐盐关键基因、解析其调控网络和分子机制至关重要，可以为利用分子设计育种技术培育优异耐盐品种奠定基础。

长期以来，遗传学家们利用全基因组QTL分析策略鉴定耐盐性相关位点，检测到一大批控制水稻各耐盐指标的QTL，为耐盐基因克隆奠定了基础。近些年，随着水稻功能基因组研究的不断深入和水稻重测序技术的快速发展，人们开始利用耐盐/盐敏感突变体鉴定和关联作图分析等手段来鉴定耐盐基因，并取得了较大进展。众多耐盐基因/QTL的定位和克隆推动了水稻耐盐性分子辅助选择育种工作的快速进行，现已有一批耐盐品种育成并推广应用。本文从这些方面出发，就国内外开展的水稻耐盐基因定位、克隆以及育种应用研究进行综述和展望。

1 水稻耐盐QTL分析

1.1耐盐QTL定位群体

用于QTL分析的作图群体可以分成永久性群体和临时性群体两类。在耐盐性QTL分析研究中，常用的永久性群体以重组自交系（recombinant inbred lines，RILs）和渐渗系（introgression lines，ILs）为主。重组自交系群体亲本组合包括Jiucaiqing×IR26、Tesanai 2×CB、(Nona Bokra× Pokkali)×(IR4630-22-2-5-1-3×IR10167-129-3-4)、IR4630×IR15324、Co39×Moroberekan、Milyang 23×Gihobyeo、H359×Acc 8558、IR29×Pokkali、Yiai 1×Lishuinuo、CSR11×MI48、CSR27× MI48等[3-17]。渐渗系群体亲本组合包括IR64×Tarom Molaii、明恢86×ZDZ057、Ilpumbyeo×Moroberekan、蜀恢527×ZDZ057、蜀恢527×特青、明恢86×特青、Lemont×特青、Pokkali×IR29、Teqing×Oryza rufipogon、Ce258×IR75862、ZGX1×IR75862、Tarome-Molaei×Tiqing、Xiushui 09×IR2061、IR64×Binam、Nipponbare×Kasalath等[18-28]。此外，还有IR64× Azucena和Zhaiyeqing 8×Jingxi 17两个组合的加倍单倍体（doubled haploid，DH）群体[29-31]。利用永久性群体进行耐盐QTL定位，可在多年多点进行表型分析，鉴定获得稳定表达、不受生长环境影响的耐盐QTL，有利于后期相关QTL的图位克隆和分子育种应用。但是，在目前的研究中，所使用的大部分永久性群体构建的主要目的不是为了进行耐盐性分析，亲本中缺乏特别耐盐或感盐的品种，且亲本间耐盐性差异较小，不利于鉴定到主效耐盐位点。仅有少数群体是以优异耐盐品种为亲本来构建的，主要用于耐盐性研究，如由Jiucaiqing×IR26、(Nona Bokra×Pokkali)×(IR4630-22-2-5-1-3× IR10167-129-3-4)、IR29×Pokkali、Pokkali×IR29、CSR11×MI48、 CSR27×MI48等组合构建的重组自交系或渐渗系群体[3-5, 7, 13, 16, 17, 23]。

水稻耐盐种质资源的耐盐QTL定位工作，主要是利用临时性群体来进行的。这些群体主要为F2和F3群体，另有少量的F4、BC1F1、BC1F2：3、BC2F2：3群体。相关定位群体的亲本组合包括:Gharib× Sepidroud、Nona Bokra×Koshihikari、Tarommahali× Khazar、Pokkali×Shaheen Basmati、BRRI Dhan40× IR61920-3B-22-2-1、Dongnong 425× Changbai 10、Jiucaiqing× IR26、Sadri×FL478、NERICA-L-19× Hasawi、Sahel 108×Hasawi、BG90-2× Hasawi、IR36× Pokkali、CSR27×MI48、Cheriviruppu×Pusa Basmati 1、Peta× Pokkali等，主要用于对Gharib、Nona Bokra、Tarommahali、Pokkali、Jiucaiqing、FL478、Hasawi 、IR61920-3B-22-2-1、Cheriviruppu、Changbai10、CSR27等优异水稻耐盐材料的耐盐QTL分析[32-49]。

有些研究同时利用两个或多个群体来进行耐盐QTL分析。Tiwari等[16]对CSR11×MI48和CSR27×MI48两个RIL群体的耐盐QTL进行了鉴定；Cheng等[25]和杨静等[21]分别利用Xiushui09×IR2061和Lemont×特青组合的双向导入系进行了耐盐QTL的定位和比较；钱益亮等[20]对蜀恢527×ZDZ057、明恢86×ZDZ057、蜀恢527×特青、明恢86×特青4个产量选择导入系的耐盐QTL进行了分析；Sun等[42]同时利用Dongnong 425×Changbai 10组合的F3和BC1F2：3群体分析了控制水稻根中离子含量的动态QTL；Bimpong等[44]利用NERICA-L-19×Hasawi、Sahel 108×Hasawi和BG90-2×Hasawi 3个F2群体，来鉴定Hasawi中的耐盐QTL。结合多个定位群体来进行QTL分析和比较，更有利于寻找到能够稳定表达、受遗传背景影响较小的耐盐位点，应用于分子辅助选择育种。

1.2耐盐鉴定时期和鉴定方法

众多研究表明，水稻对盐胁迫的耐性在不同生长发育时期有所不同。其中，幼苗期和生殖生长期是两个盐敏感时期，而种子萌发期和营养生长期植株耐盐性相对较强[50]。因此，大多数研究是针对水稻幼苗期和生殖生长期耐盐性来进行QTL分析的。

在已报道的水稻耐盐性QTL分析研究中，一半以上是以幼苗期耐盐性为研究目标的。在不同研究中，幼苗期耐盐性鉴定的方法相对较为统一，一般采用水培方式培养水稻幼苗，于3叶期前后进行耐盐处理[4-14, 18-26, 28, 30, 33-36, 38, 39, 41, 49]。水稻生殖生长期耐盐性鉴定一般是在人工盐池中进行的，少量研究采用土培浇灌盐水的方式进行盐处理[16,17,31,37,43-49]。盐处理开始的时期和盐处理时间的长短在不同研究中有所不同。大多数研究是将苗期或分蘖期的水稻植株移栽至盐池，生长至成熟期，进行农艺性状和耐盐生理指标测定[16, 17, 31, 37, 43-46, 48]。也有研究者仅对孕穗或开花期的水稻植株进行短期盐处理（1周或20 d），即取样进行耐盐性指标测定[47,49]。

另有一些研究对营养生长期的水稻植株进行了耐盐性鉴定，通常是将苗期或分蘖期的水稻植株进行盐处理30～90 d不等[15,17,27,28,40,42,48,49]。水稻种子萌发期耐盐QTL分析研究相对较少，一般采用常规培养皿发芽法，添加盐溶液进行处理[3,29,32]。

此外，还有一些研究同时对两个或多个生长发育时期的耐盐性进行了QTL分析，顾兴友等[48]和Pandit等[17]鉴定了水稻营养生长期和生殖生长期的耐盐性；Zang等[28]鉴定了水稻幼苗期和营养生长期的耐盐性；Ammar等[49]同时分析了水稻幼苗期、营养生长期和生殖生长期的耐盐QTL。这些研究为鉴定同时控制水稻多个生长发育时期耐盐性的基因奠定了基础。

为了分析植株本身发育差异对耐盐性的影响，一些研究在试验中设置了对照组，同时对盐处理和对照环境下的定位群体的耐盐性进行了鉴定[3,4,16,19, 22, 27-29, 31, 42, 44-46, 48]。这些研究主要利用的是各株系在遗传上纯合的永久性群体，也有研究利用的是F2群体，采取的是剥分蘖方式，不同分蘖用于不同处理试验。

1.3耐盐评价指标

水稻耐盐性是一个复杂的综合性状，其评价指标多种多样，不同生长发育时期耐盐性的评价指标也有所不同。在水稻耐盐QTL分析研究中，幼苗期耐盐评价指标大致可以分成形态、生长和生理指标三大类。形态指标分析主要是通过观察盐胁迫后水稻植株叶尖、叶片、分蘖及整个植株的生长受抑和死亡程度等来评价幼苗的盐害级别(score of salt toxicity of leaves, SST)，并调查幼苗在盐胁迫后的存活天数（SDS）[4-6, 9-11, 13, 14, 18-23, 25, 26, 28, 30, 33, 34, 36, 38,39,41,49]。大多数研究参照国际水稻所（IRRI）提出的水稻标准评价系统（standard evaluation system，SES）来评价每个株系幼苗的盐害级别，其中，部分研究根据实验材料和实验设计将评价标准略做修改[4, 10, 11, 13, 18, 20, 21, 23, 25, 26, 28, 33, 36, 38, 39, 41, 49, 51]。常用来进行幼苗期耐盐性评价的生长指标主要包括苗高、地上部鲜质量和干质量、根鲜质量和干质量等[5, 8, 9, 13, 19, 22, 33, 35, 36, 38]。评价水稻耐盐性的生理参数相对较多，其中用于QTL分析的主要是和植株离子含量相关的指标，主要包括地上部Na+含量（SNC）、地上部K+含量（SKC）、地上部Na+/K+（SNKR）、地下部Na+含量（RNC）、地下部K+含量（SKC）、地下部Na+/K+(RNKR）等[4,5,7-9,12,13,18, 21, 24-26, 28, 33-36, 38, 41]。个别研究也对盐胁迫后幼苗叶片的叶绿素含量进行了QTL分析[13,33,35]。

水稻种子萌发期耐盐性的评价指标主要有发芽率和发芽势，有些研究会进一步对萌发后的幼苗的胚芽和胚根的生长量进行分析[3,29,32]。水稻营养生长期的耐盐性评价指标主要是植株生长和生理指标，多数研究分析了植株地上部的生长量和离子含量，而对根部性状研究较少[15, 17, 27, 28, 40, 42, 48, 49]。水稻生殖生长期的耐盐性评价主要是考查水稻与产量相关的农艺性状，如抽穗期、株高、分蘖数、每株穗数、每穗粒数、结实率、千粒重、单株产量等[16, 17, 31, 37, 43, 44, 46-48]。也有一些研究对盐处理后的水稻叶片（旗叶或所有叶）或秸秆中的Na+、K+、Ca2+、Cl－等离子进行了含量测定，并作为生殖生长期耐盐性评价指标[17, 43, 45, 49]。

在一些设置了对照组的研究中，除了使用各评价指标的绝对值进行对照和处理组各耐盐相关性状进行QTL分析比较外，还常以各耐盐性状的相对值（胁迫组数值/对照组数值）或下降率[(对照组-胁迫组)/对照组]作为指标，这样有利于减少植株本身发育差异对表型鉴定的影响[16, 19, 22, 29, 42, 45, 46, 48]。

1.4耐盐QTL

在统计的47个水稻耐盐QTL分析研究中，共检测到964个耐盐相关QTL（表1）。其中，幼苗期耐盐QTL数目最多，有514个（对），超过总数的一半；种子萌发期、营养生长期和生殖生长期的耐盐QTL数目分别为31、149和270个。各个生长发育时期的耐盐QTL在水稻12条染色体上均有分布。

在有表型贡献率统计的759个耐盐QTL（上位性QTL除外）中，单个QTL可提供的表型贡献率为0.02%～81.56%；表型贡献率在20%以上的QTL有167个，占总QTL数目的22.0%（表1）。这些表型贡献率较大的耐盐QTL主要集中在以下5个研究中[13,20,35,44,49]。Thomson等[13]检测到16个表型贡献率在20%以上的幼苗期耐盐QTL，其中，有5个QTL的表型贡献率在50%以上。钱益亮等[20]利用4个作图群体共检测到43个控制幼苗SST或SDS的QTL，其中，有12个QTL的表型贡献率在20%以上。Sabouri等[35]鉴定到32个控制水稻苗期耐盐性不同生长和生理指标的QTL，其中，有14个QTL的表型贡献率超过20%。Bimpong等[44]利用3个作图群体检测到75个水稻生殖期耐盐QTL，其中，约有一半的QTL（37个）的表型贡献率超过20%。Ammar等[49]检测到25个表型贡献率在10%以上的控制幼苗期、营养生长期或生殖生长期耐盐性的QTL，其中，表型贡献率大于20%的有22个。在以上研究中，检测到的表型贡献率在20%以上的耐盐QTL共有101个。其他研究检测到的效应较大的QTL相对较少，其中，在13个研究中未检测到表型变异率大于20%的耐盐QTL[4,6,8,9,17, 19, 23, 25, 26, 29, 38, 40, 41]。

1.5水稻耐盐QTL的精细定位和图位克隆

由于检测到的大多数水稻耐盐QTL的表型贡献率较小，精细定位和克隆难度较大，所以相关研究一直进展较慢。目前报道的精细定位或图位克隆的QTL主要有位于水稻第1染色体上的qSKC-1和Saltol两个位点。

qSKC-1是在耐盐品种Nona Bokra与盐敏感品种Koshihikari构建的F2群体中检测到的一个控制地上部K+含量的主效QTL，解释总表型变异的40.1%[34]。Ren等[52]利用图位克隆方法，经BC2F2群体精细定位和BC3F2群体高精度连锁分析，将qSKC-1限定在7.4 kb的染色体区间内，并最终将qSKC-1基因分离。该基因编码一个HKT（High-affinity K+transporter）家族的离子转运蛋白（OsHKT1;5），主要存在于水稻根的木质部薄壁细胞中，具有专一性运输Na+的功能。该转运蛋白可能主动将Na+运出木质部，经过其他Na+转运体的作用将Na+从韧皮部运回至根部并排出体外，从而降低地上部Na+含量，调节地上部K+/Na+平衡，提高水稻耐盐性[52]。

Gregorio[53]利用AFLP标记对Pokkali/IR29组合的F8重组自交系群体进行耐盐QTL分析，在水稻第1染色体上检测到一个同时控制水稻植株Na+、K+含量和Na+/K+的主效QTL，命名为Saltol。在该群体中，Saltol位点的LOD值大于14.5，表型贡献率为64.3%～80.2%。随后，Bonilla等[54]利用同一作图群体，将Saltol定位到SSR标记RM23和RM140之间的染色体区段，并发现Saltol位点对Na+、K+含量和Na+/K+的表型贡献率分别为39.2%、43.9%和43.2%。Niones[55]和Thomson等[13]分别利用以IR29为背景、Pokkali为供体的BC3F4和BC3F5代近等基因系进一步确认了Saltol位点在染色体上的位置。目前，Saltol的精细定位工作尚未取得突破性进展，候选基因还没有被分离。此外，由于Saltol与qSKC-1在染色体上的位置十分相近，两者又均负责调控盐胁迫下水稻植株的K+/Na+平衡，Thomson等[13]推测Saltol与 qSKC-1可能编码同一基因（OsHKT1;5），但尚未得到证实。

2 水稻耐盐/盐敏感突变体的筛选和耐盐基因克隆

2.1水稻耐盐/盐敏感突变体的筛选

为了挖掘水稻耐盐新基因，一些研究者开展了大规模的水稻耐盐/盐敏感突变体筛选工作。陈受宜等[56]从粳稻品系77-170经EMS诱变的后代中筛选到多个耐盐突变系（包括M-20株系），这些突变系在含盐0.5%的土壤中能抽穗结实，而其野生型则基本不能抽穗结实。Lee等[57]从钴60γ射线诱变的水稻品种Dongjinbyeo后代中筛选到2个耐盐株系和1个盐敏感株系。两个耐盐株系在海边盐渍土生长条件下，与野生型相比，株高、穗长、分蘖数、小穗数和产量均有所提高。Huang等[58]从9000多个EMS诱变的粳稻品种中花11号M2株系中筛选到10余个耐盐突变体株系，其中一个株系（dst）的耐旱性和耐盐性均显著提高。Nakhoda等[59]经过多轮多代筛选，从约5000份由双环氧丁烷、快中子和γ射线诱变的籼稻品种IR64的后代中，鉴定到多个耐盐性发生改变的株系，包括耐盐突变体167-1-3和盐敏感突变体S-730-1。Ashokkumar等[60]从EMS诱变的耐旱品种Nagina 22的M2株系中鉴定到3个耐盐突变体（N22-SPS-5、N22-334-3、N22-293-1），其中N22-334-3的耐盐性极强，在250 mmol/L的NaCl胁迫下仍然能够萌发。Lin等[61]从460个叠氮化钠诱变的Tainung 67 M10代株系中筛选到8个盐敏感突变体，并对其中一个盐超敏感突变体（shs1）进行了生理和生化分析。Ogawa等[62]和Toda等[63]以盐胁迫下根的生长受抑情况为指标，从日本晴Tos17突变体库约2500个株系中筛选到两个盐敏感突变体rss1和rss3。汪斌等[64]在籼稻品种R401辐射诱变的M2群体中筛选到一个苗期耐盐突变体sst。Takagi等[65]筛选了6000份EMS诱变的粳稻品种Hitomebore的M4株系，鉴定到一个耐盐突变体hst1。

近些年，我们对1万余份EMS和钴60γ射线诱变的粳稻品种日本晴M2代株系进行了幼苗期耐盐性筛选，从中鉴定到耐盐/盐敏感突变体10余份，已经报道的有rss2、rss4和rst1[66-68]。rss2和rss4均为盐敏感突变体，但在盐胁迫下的表型和生理特征有所不同。rss2在种子萌发期、幼苗期和孕穗期均表现对盐胁迫敏感。盐胁迫下，与其野生型相比，rss2幼苗地上部Na+含量显著升高、根中K+含量显著降低。rss4幼苗在盐胁迫下生长明显受抑，地上部和根中积累较多的Na+，其中地上部的Na+主要积累在老叶中。rst1为一个耐盐突变体。盐胁迫下，rst1幼苗地上部生物量和叶绿素含量显著高于野生型，脂质过氧化水平和电解质渗透率显著低于野生型，幼苗死亡率显著低于野生型。rst1突变体耐盐性提高可能主要归因于其限制植株地上部Na+积累的能力显著加强。

通过这些研究，目前报道的水稻耐盐/盐敏感突变体已接近20个，为耐盐新基因的定位和克隆奠定了基础。但是，除rss1和rss3外，其余突变体均是通过传统的物理或化学诱变得来的，要想克隆相关突变基因，需要经过复杂的基因定位和精细定位工作，难度较大。筛选鉴定利用T-DNA、转座子（Ac/Ds）和逆转座子（Tos17） 等插入元件构建的水稻插入突变体，可以大大节省后期的突变基因分离时间，但目前利用水稻插入突变体库进行耐盐性筛选还较少见，今后应该加强研究。

2.2水稻耐盐/盐敏感突变基因的定位和克隆

一些研究仅对筛选到的耐盐/盐敏感突变体进行了初步定位分析。陈受宜等[56]、Zhang等[69]和丁海媛等[70]将粳稻77-170的耐盐突变体M20的耐盐主效基因定位在第7染色体上。Lee等[57]鉴定到2个在耐盐突变株系（18-1和50-1）和盐敏感突变体株系（25-1）间存在多态性的RAPD标记。Ghaffari等[71]利用比较蛋白组学分析手段，鉴定到34个在耐盐突变体167-1-3、感盐突变体S-730-1及其野生型IR64的地上部间存在差异表达的盐胁迫响应蛋白。

另有一些较为深入的研究对耐盐/盐敏感突变体开展了精细定位和克隆工作。Lan等[72]将幼苗耐盐突变体基因SST精细定位到水稻第6染色体BAC克隆B1047G05上的17 kb区间内，在此区间仅存在一个预测基因，编码OsSPL10（SQUAMOSA promoter-binding-like protein 10)蛋白，可能为SST的候选基因。与野生型相比，sst突变体中该基因ORF第232位碱基发生了缺失，造成移码突变，导致蛋白翻译提前终止。Huang等[58]将控制dst突变体耐盐性的突变体位点定位到水稻第3染色体分子标记H2423和H2437之间14 kb的染色体区间，分离到一个控制水稻耐盐性的新型锌指转录因子DST。DST具有转录激活活性，可以与活性氧动态平衡相关基因启动子上的DBS元件直接结合，调节这些基因的表达，影响活性氧的积累，从而调节气孔开度，影响水稻的耐旱和耐盐性。Ogawa等[62]和Toda等[63]分别利用盐敏感突变体rss1和rss3克隆到耐盐相关基因RSS1和RSS3。RSS1参与细胞周期的调控，是维持盐胁迫下分生细胞活性和活力的一个重要因子；RSS3调控茉莉酸响应基因的表达，在盐胁迫环境下维持根细胞以适宜速率伸长方面起到重要作用。Takagi等[65]利用新兴的MutMap基因定位技术，快速鉴定到控制hst1突变体耐盐性增强的基因位点（OsRR22），该基因编码一个B型响应调节子蛋白。这些研究利用水稻耐盐/盐敏感突变体，顺利克隆到了多个耐盐重要基因，充分表明利用突变体来分离水稻耐盐相关基因是一条可行途径。随着MutMap技术的快速发展与应用，相关研究工作会更高效。

我们以植株地上部Na+含量为耐盐评价指标，对鉴定到的耐盐/盐敏感突变体rst1、rss2和rss4分别进行了遗传分析和基因定位研究[66-68]。利用突变体与日本晴野生型构建的F2群体进行的遗传分析表明，rss2、rss4和rst1的耐盐性变化均由单个基因发生隐性突变导致。在rss2基因定位研究中，我们构建了rss2/窄叶青8号F2作图群体。该群体地上部Na+含量呈连续分布，表明亲本间的地上部Na+含量差异由多个基因控制。因此，我们利用全基因组QTL扫描策略来寻找感盐突变体基因，在第1和第6染色体上检测到2个控制地上部Na+含量的QTL（qSNC-1和qSNC-6），这两个QTL分别解释表型变异的14.5%和53.3%，增效等位基因均来源于rss2。为了确定哪一个QTL是导致rss2耐盐性降低的突变位点，我们利用日本晴/窄叶青8号F2群体，构建了第1和第6染色体的遗传图谱，并进行了QTL分析和比较。结果表明，在该群体中，qSNC-1被检测到，而qSNC-6未能检测到。由于qSNC-1在两个定位群体中均能够被检测到，表明该位点的等位基因差异可能在日本晴和窄叶青8号中本来就存在，而不是由于基因突变所导致。由此，我们将仅在rss2/窄叶青8号群体中检测到的qSNC-6确定为目的耐盐突变基因。我们进一步利用更大的rss2/窄叶青8号作图群体对rss2候选位点进行了验证，并利用隐性极端个体将其精细定位到605.3 kb（21 961 962 - 22 566 880 bp）范围内。利用相似的研究方法，我们分别对rss4和rst1突变体中的盐敏感/耐盐突变基因进行了精细定位。rss4位于第6染色体上28 475 807 bp和28 706 291 bp之间的230.5 kb区段内，rst1基因位于同一染色体上29 432 299 bp和 29 702 745 bp之间270.4 kb的区段上[66-68]。

目前，rss2、rss4和rst1的基因定位工作已基本完成，分离到的候选基因正在进行相应的功能互补验证和作用机制分析研究（未发表数据）。通过这些研究，我们不仅鉴定到3个控制水稻耐盐性的新位点，还发现地上部Na+含量可以作为评价水稻耐盐性的可靠指标，利用此生理参数进行耐盐QTL分析，有望发现耐盐主效QTL，为耐盐关键基因克隆和应用奠定基础[68]。

3 水稻耐盐性关联分析

传统的QTL定位通常是利用各类标记对由双亲杂交F1衍生的后代分离群体进行连锁分析。利用这种连锁分析方法进行QTL检测，需要构建作图群体，周期较长，而且作图精度有限，可检测的等位基因数量也少。基于连锁不平衡的关联分析可以很好地克服这些局限性，被越来越广泛地应用于解析植物的各类数量性状[73]。近年来，关联分析也逐渐被应用于水稻耐盐性的基因鉴定工作，并取得了一些研究进展。

3.1耐盐候选基因关联分析

为了鉴定欧洲水稻核心种质库（European Rice Corecollection，ERCC）180份粳稻中的耐盐QTL或候选基因，Ahmadi等[74]利用124个SNP和52个SSR标记对14个耐盐QTL和65个耐盐候选基因进行了关联，鉴定到19个与一个或多个盐胁迫响应性状显著关联的基因位点。Negrão等[75]以392份水稻种质资源为研究对象，利用EcoTILLING技术检测了这些材料中与Na+/K+平衡、信号级联和胁迫保护等相关的5个耐盐候选基因（OsCPK17、OsRMC、OsNHX1、OsHKT1;5和SalT）的等位基因多态性，在这些基因的编码序列中检测到40个新的等位基因，并通过关联分析鉴定到11个与水稻耐盐性相关的SNP。

通过关联分析，不仅鉴定到与水稻耐盐性相关的QTL、候选基因或等位基因，还发现不同基因型水稻具有不同的耐盐机制，但没有任何一个水稻材料在所有耐盐基因位点均携带有利等位基因[74,75]。

3.2耐盐性SSR关联分析

近期，有两个研究分别利用SSR标记对300余份水稻资源进行了苗期和全生育期耐盐性关联分析。Zheng等[76]以幼苗存活天数（SDS）和地上部K+/Na+为评价指标，鉴定了341份粳稻的幼苗期耐盐性，并利用160对SSR标记进行了耐盐性关联分析。该研究检测到10个与耐盐性显著关联的SSR标记，其中，有9个标记与已报道的水稻耐盐相关QTL在染色体上的位置接近，有4个标记与已知的耐盐相关基因（OsEREBP1、OsABF2、HKT1;5、OsAHP1）位置一致。Cui等[77]将347份粳稻种植于沿海滩涂，考查了抽穗期、株高、有效穗数、每穗粒数、小穗育性、千粒重等农艺性状，并以这些性状的盐胁迫指数为评价指标，利用148个SSR标记进行耐盐性关联分析。该研究鉴定到25个与水稻耐盐性连锁的SSR标记，这些标记分别位于除第5和6之外的其余10条染色体上，各位点解释表型变异率为4.58%～31.65%。在这些位点中，有10个标记与以前报道过的耐盐QTL在染色体上的位置一致或接近。

3.3耐盐性全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)

Kumar等[78]利用GWAS技术来鉴定水稻耐盐性基因位点。该研究利用包含6000个SNP的芯片分析了220份水稻材料的基因型，对与生殖生长期耐盐性相关的12个农艺性状及叶的Na+和K+积累进行了关联分析。鉴定到20个与叶Na+/K+显著相关的SNP（基因位点），以及44个与其他耐盐性状相关的SNP（基因位点），这些基因位点分别解释表型变异的5%～18%。在鉴定到的与Na+/K+显著相关的SNP中，有12个SNP位于第1染色体上，与以前多次报道Saltol位置一致，推测Saltol可能同时控制水稻幼苗期和生殖期的耐盐性；其余8个SNP分别位于水稻第4、6和7染色体上，在相应区段可能存在新的控制Na+/K+的QTL位点。在鉴定到的与农艺性状连锁的SNP中，也有多个与以前报道过的耐盐QTL或基因位置一致。如:位于第8染色体上，与小穗育性胁迫敏感指数连锁的一个SNP（chr8： 5109310），与Pandit等[17]和Islam等[39]检测到的分别控制小穗育性胁迫敏感指数、秸秆Na+含量和盐害级别的QTL（qSSISFH8.1、qNaSH8.1、SalTol8.1）位置相近；在第1染色体上，与实粒数连锁的一个SNP（40514883），位于水稻幼苗期干旱、盐和冷耐性调控基因OsNAC6/SNAC2附近[78]。

目前，水稻耐盐性关联分析研究还相对较少，尤其是基于全基因组重测序的GWAS在水稻耐盐性研究中的应用还刚刚起步。随着近期3000份水稻核心种质重测序项目的完成，以及其他越来越多的水稻品种重测序工作的开展，水稻耐盐性GWAS研究也会得到迅速发展[79]。

4 水稻耐盐性MAS育种

世界范围内的水稻耐盐品种培育已有70多年的历史，传统育种方法，如地方品种的引进和选择、系谱法、改良混合系谱法、诱变和穿梭育种等方法在印度、菲律宾等地区大量开展，培育出了CSR1、CSR10、CSR27、IR2151、Pobbeli、PSBRc 84、PSBRc 48、PSBRc 50、PSBRc 86、PSBRc 88和NSIC 106等耐盐水稻品种[80,81]。但是，总体上，水稻耐盐品种选育成功率较低，进展缓慢。其可能原因主要有:缺乏对耐盐性复杂遗传基础的了解，缺乏足够的抗性资源，盐害地区具有复杂性和多样性，缺乏精确可靠的筛选技术，缺乏足够的研究经费支持[80,81]。

随着分子标记技术的快速发展，MAS技术在作物育种过程中得到广泛引用，为加速水稻耐盐遗传改良提供了新途径。MAS可以在早代对目标性状进行准确选择，加速育种进程；可以同时聚合多个有利基因，提高育种效率；还可以显著减轻回交育种进程中普遍存在的连锁累赘现象，利于优良基因的有效导入[80]。在耐盐、耐旱和抗病等抗逆性育种中，表型鉴定较为困难，而且早代表型鉴定可能会导致一些植株死亡或种子绝收，丧失许多综合性状表现优异的个体。利用MAS技术进行抗逆性育种，可以在早代对目标QTL或基因进行前景选择，延迟对目标性状的表型鉴定，有利于在育种初期积累较大的育种群体，加速优良品种的选育进程[80]。

MAS的有效性和可靠程度取决于目标性状基因座位与标记座位之间的重组率，与目标QTL紧密连锁的分子标记的鉴定是MAS顺利实施的前提条件。众多水稻耐盐QTL和连锁标记的鉴定为利用MAS技术培育水稻耐盐品种奠定了基础，但是，由于大多数QTL尚未被精细定位，缺乏紧密连锁的分子标记，很难被应用于MAS育种实践。目前，在MAS育种中被广泛应用的水稻耐盐QTL主要是位于第1染色体上的Saltol，另有位于第8染色体上的两个耐盐QTL正逐渐受到关注。

4.1Saltol的MAS育种

在印度、菲律宾、泰国、越南、孟加拉国和塞内加尔等众多水稻种植国家，均有开展Saltol的MAS育种工作[80,82]。相关工作大多是采用标记辅助回交（marker assisted backcrossing, MABC）技术完成的，其过程大致如下:将Saltol供体亲本与受体亲本杂交；进行3次回交，在每个回交世代，利用Saltol紧密连锁标记进行前景选择，利用其他标记进行背景选择；最后，筛选出Saltol供体等位基因被固定且耐盐性增强的重组个体。在这些MABC育种实践中，常会结合表型选择，加速背景恢复；还常用逐步转育、同时转育、同时逐步转育的方法进行QTL聚合。

在印度，Singh等[83]和Babu等[84]以Saltol紧密连锁标记RM8094、RM3412和RM493为前景选择标记，利用MABC技术，将供体亲本FL478(来源于Pokkali/IR29杂交组合的一个重组自交系)中的Saltol转育到轮回亲本Pusa Basmati 1121和Pusa Basmati 6中；之后，多个育种单位又继续以 FL478为供体亲本，陆续将Saltol转育到其他一些水稻品种中，如ADT 45、CR 1009、Sarjoo 52、Pusa 44、PR114、Gayatri、Savithri、MTU 1010、White Ponni和ADT45等[80,85]。在越南，Linh等[86]利用MABC法，将供体亲本FL478中的Saltol转育到优质高产水稻品种BT7中。在菲律宾，IRRI与STRASA(Stress-Tolerant Rice for Africa and South Asia)合作，将Saltol转育到BRRI dhan 28、IR64、BR11和Swarna等品种中[80,87]。在塞内加尔，Bimpong等[82]利用MABC法，将FL478中的Saltol转育到主栽品种Rassi中。

各国对Saltol的MAS育种大大推动了水稻耐盐新品种的培育。目前，利用MAS培育的一些Saltol的渐渗系如BR11-SalTol和BRRI dhan28-SalTol已经在菲律宾、孟加拉国、印度和越南受盐害影响的海滨地区进行了田间试验[82,88]。IRRI培育出的携带Saltol的耐盐水稻品种IR63307-4B-4-3（在孟加拉国改名为BRRI dhan47），在菲律宾和孟加拉国推广种植[89]。2009年至2013年，IRRI在印度和孟加拉国逐渐推广了NDRK 5088、BINA dhan 8、BRRI dhan 53、BRRI Ddhan 54、BRRI dhan 55、CSR43、BINA dhan 10、CR dhan 405、CR dhan 406、BRRI dhan 61等10个耐盐水稻品种[87]。最近，Bimpong等[82]通过4个季节的田间试验，鉴定到16个盐胁迫下产量损失相对较小（3%～26%）的Saltol渐渗系，并将这些材料的种子提交给非洲的水稻育种工作组。已有6个西非国家（冈比亚、几内亚比绍、几内亚、尼日利亚、塞内加尔、塞拉利昂）在2014年和2015年雨季，对这些材料进行了田间试验。根据育种实践，Bimpong等[82]还发现，与传统育种相比，MAS育种至少可以将种质改良时间缩短4～7年。

4.2其他耐盐QTL的MAS育种

在水稻耐盐育种过程中，育种家重点对Saltol进行转育的同时，还关注到另外一个位于第8染色体上控制水稻幼苗期耐盐性的QTL，SSR标记RM223与该位点紧密连锁。Lang等[90,91]将RM223标记广泛应用于水稻耐盐性MAS育种，培育出了一系列耐盐水稻品种。其中，一部分优异的耐盐品种如OM4498、OM5629、OM5891和OM4900等已被成功选育，并大面积推广。

此外，在水稻第8染色体上还存在另外一个耐盐性相关QTL—qSSISFH8.1。qSSISFH8.1是Pandit等[17]利用CSR27×MI48杂交组合的RIL群体进行生殖生长期耐盐QTL定位时，鉴定到的一个控制小穗育性胁迫敏感指数的QTL。该位点位于水稻第8染色体上SSR标记HvSSR08-25和RM3395之间，表型贡献率为8.00%，加性效应为-0.03，正向效应等位基因来源于盐敏感亲本MI48。为了培育在幼苗期和生殖生长时期均表现耐盐的水稻品种，Singh等[85]在将Saltol不断转育到众多水稻品种中的同时，也正加紧进行qSSISFH8.1和Saltol的聚合育种。

5 问题与展望

在目前的水稻耐盐基因定位和克隆工作中，大多数研究仅针对某一个生长发育时期进行耐盐性评价，尤以幼苗期耐盐性研究为最多，而将多个生长阶段耐盐性结合起来比较分析的研究相对较少。由于水稻在不同生长发育阶段的耐盐能力有所不同，某一生长发育阶段的耐盐性与其他阶段可能不存在明显的相关性，其遗传基础也可能存在差异。因此，有必要同时对水稻不同生长发育时期，尤其是幼苗期和生殖生长期的耐盐性进行QTL分析或关联作图，以鉴定同时控制多个生长阶段耐盐性的优异基因，用于水稻耐盐品种培育。这项工作可能要从筛选全生育期耐盐水稻种质资源开始，鉴定出在盐胁迫下能顺利完成生命周期，并且产量性状受影响较小的材料，用于后期的耐盐基因定位、克隆与育种实践工作。

尽管人们已经鉴定到了数百个耐盐相关QTL，但后续的基因精细定位和图位克隆工作进展缓慢。这可能主要是由于多数定位群体的亲本组合中缺乏耐盐性强的水稻品种，且两亲本间耐盐性差异较小，导致鉴定到的QTL的表型贡献率较小，进一步的精细定位容易受到遗传背景的干扰。另一方面，在大多数耐盐性QTL定位研究中，仅进行了单次或单年单点的表型鉴定工作，缺少对QTL稳定性的检测。鉴定到的一些表型贡献率较大（20%以上）的耐盐QTL，可能由于遗传稳定性较差，而难以被精细定位和克隆。因此，不仅要选择强耐盐水稻品种来进行耐盐QTL定位，还要通过多次或多年多点试验来检测耐盐QTL的稳定性，从中鉴定到遗传效应较大、且能够稳定表达的耐盐QTL，用于耐盐基因克隆和耐盐育种实践。

利用突变体来分离耐盐基因已成为水稻耐盐新基因挖掘的有效途径之一，有必要加强水稻耐盐/盐敏感突变体的筛选鉴定和基因克隆工作。目前，大规模筛选鉴定水稻耐盐/盐敏感突变体的研究还较少，而且专门针对耐盐性筛选来构建饱和突变体库的研究鲜有报道，已报道的相关突变体的野生型亲本中缺乏耐盐能力强的水稻品种。今后，在优异耐盐种质资源的耐盐基因挖掘工作中，除了采用传统的QTL分析方法，还可以结合突变体构建和筛选来进行。此外，随着关联分析，特别是GWAS技术被越来越广泛地应用于植物复杂性状的解析，在水稻耐盐基因挖掘工作中也要重视该方面的研究。

水稻耐盐基因定位与克隆研究的一个重要目的是为了利用MAS或转基因技术培育耐盐水稻品种。在世界范围内的水稻耐盐性遗传改良中，MAS已显示出巨大的应用价值和潜力，越来越受到育种家的青睐。但是，已有工作大多是围绕Saltol一个耐盐QTL的转育开展的，这使得育成的品种耐盐性遗传基础单一，难以适应不同类型的盐渍地环境，大面积推广受到限制。精细定位更多耐盐QTL、开发相关紧密连锁分子标记，并同时考虑将控制不同生育期耐盐性的QTL进行MAS聚合育种，是今后水稻耐盐遗传改良工作的重点。另一方面，与菲律宾、印度等国家相比，中国的水稻耐盐性遗传改良工作还比较落后，尤其是耐盐性MAS育种工作才刚刚起步。最近启动的国家科技支撑计划“耐盐水稻新品种选育及配套栽培技术研究”项目，可能会加速该方面研究的进行。

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Research Progress on Gene Mapping and Cloning for Salt Tolerance and Variety Improvement for Salt Tolerance by Molecular Marker-Assisted Selection in Rice

JING Wen*, ZHANG Wenhua
(Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;*Corresponding author, E-mail: jingwen@njau.edu.cn)

Soil salinization severely restricts the development of rice production, and improving salt tolerance in rice has become one of the most important objectives in rice breeding programs. Isolation of novel genes involved in salt tolerance and clarifying its molecular mechanism can lay a foundation for the genetic improvement of salt tolerance in rice. In this paper, we summarized the the progress on mapping of quantitative trait loci (QTL) for rice salt tolerance in the following aspects： mapping populations, growth stages for evaluation of salt tolerance and evaluation methods, evaluation parameters of salt tolerance, QTLs involved in salt tolerance, fine mapping and map-based cloning of QTLs for salt tolerance. We also introduced recent progress on genetic screening and gene cloning of salt-tolerant and salt-sensitive mutants, as well as association mapping of salt tolerance in rice. Additionally, we reviewed the recent advances in variety improvement for salt tolerance by molecular marker-assisted selection in rice.

rice；salt tolerance；gene mapping；gene cloning；molecular marker-assisted selection；variety improvement

Q755; S511.034

A

1001-7216(2017)02-0111-13

2016-05-16; 修改稿收到日期:2016-09-12。

国家自然科学基金资助项目(31301294); 国家科技支撑计划资助项目(2015BAD01B01)。