水稻脆秆突变体bc1-wu3的鉴定与基因克隆

许作鹏 仲崇元 张丽佳 刘巧泉

水稻脆秆突变体bc1-wu3的鉴定与基因克隆

许作鹏 仲崇元 张丽佳 刘巧泉*

(扬州大学 农学院 植物功能基因组学教育部重点实验室/江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心, 江苏 扬州225009;*通讯联系人, E-mail：qqliu@yzu.edu.cn)

【目的】茎秆机械强度与植株抗倒伏性直接相关。发掘脆秆突变体，克隆其相关基因有助于了解茎秆机械强度遗传机制，为抗倒伏育种提供理论依据。【方法】在经60Co-γ诱变的粳稻品种武育粳3号后代群体中获得一个脆秆突变体，命名为bc1 -wu3（brittle culm 1 from Wuyujing3），以突变体bc1 -wu3为母本，Kasalath为父本构建相应的F2分离群体，采用图位克隆的方法定位相应脆秆基因。【结果】与野生型相比，突变体的叶片、叶鞘、茎秆等组织在全生育期始终表现为脆性，易折断；穗长和粒长显著降低，粒宽显著增加。茎秆细胞细胞壁糖成分测定表明，细胞壁中纤维素含量极显著下降，而木糖、葡萄糖及阿拉伯糖含量则显著增加。茎秆切片观察发现突变体茎秆的厚壁细胞层数减少，厚壁细胞细胞壁极显著变薄。遗传分析表明，bc1- wu3脆性性状受1对隐性核基因控制。采用图位克隆的技术将该基因定位于第3染色体标记MK12与MK18之间，物理距离为57 kb，在此定位区段内包含1个已克隆的脆性基因BC1（LOC_Os03g30250）。测序结果表明，突变体bc1-wu3中BC1基因第2外显子内（CDS 659处）有1个碱基的替换(G-T)，导致编码氨基酸由半胱氨酸变异为苯丙氨酸。实时荧光定量PCR结果表明，BC1基因在脆秆突变体bc1-wu3茎秆中的表达量显著降低。【结论】据此推断本研究中定位的脆秆基因bc1-wu3为BC1新等位基因。相关结果加深了对BC1基因功能的认识，有助于阐明水稻茎秆强度遗传机制。

水稻；脆秆突变体；BC1基因；遗传分析；基因定位

水稻是重要的粮食作物，其产量直接关系粮食安全。在众多影响产量的因素中，倒伏是重要的限制因子[1-2]。茎秆是水稻的重要组织，支撑着整个植株的质量。茎秆的机械强度与抗倒伏性密切相关，是影响水稻产量的重要农艺性状之一。茎秆的机械强度取决于茎秆机械组织的特性和发育状况，是细胞壁的次生壁理化性质的具体体现[3-4]。在自然或人工诱变情况下，与细胞壁合成相关基因的突变会引起植株茎秆机械强度降低，产生脆秆突变体。脆秆突变体是阐明茎秆机械强度遗传机制及细胞壁合成调控机制的理想材料，同时在水稻生产上也具有重要的应用价值[5]。

目前已报道的脆秆突变体有20多个，已克隆的控制茎秆机械强度的基因有10个[6]。BC14/OsNST1基因调控非纤维素多糖的形成，突变后植株细胞壁中纤维素含量降低，细胞壁结构改变，导致茎秆机械强度降低和植株发育异常[7]。BC10参与细胞壁多糖的形成，突变导致茎秆和叶片的脆性增加，茎秆机械强度降低[8]；BC3/DRP2B 编码1个经典的发动蛋白OsDRP2B，突变后茎秆机械强度显著降低[9-10]；OsCesA4、OsCesA7和OsCesA9直接影响纤维素合成，突变后茎秆机械强度显著下降[11-15]；BC1编码类COBRA蛋白，BC12/KIF4编码驱动蛋白，基因突变后会影响纤维素微纤丝排列和沉积，茎秆机械强度显著下降[16-17]；BC15/OsCTL1编码1个膜相关的类几丁质酶蛋白，基因突变后细胞壁中纤维素含量降低[18]；CEF1/OsMYB103L突变影响水稻次生壁合成，导致纤维素合成减少以及机械强度降低等[19]。通过克隆这些水稻控制茎秆机械强度的基因，我们对茎秆机械强度遗传机制及细胞壁合成途径有了一定的认识。因此，进一步发掘脆秆突变体，并利用这些材料开展研究有助于完善对茎秆机械强度遗传机制的认识，为解析复杂的倒伏性状提供一个很好的切入点。

利用60Co-γ诱变粳稻品种武育粳3号，在其后代中获得1份脆秆突变体, 命名为bc1-wu3。我们仔细观察了该突变体的表型和茎秆细胞形态结构，并测定了茎秆细胞细胞壁中相关糖组分的含量,分析了突变体脆性产生的理化基础；通过遗传分析并利用图位克隆的技术确定了控制该脆性性状的候选基因。序列和表达分析推断bc1-wu3突变基因是BC1基因的新等位基因。

1 材料与方法

1.1试验材料

2012年，在粳稻品种武育粳3号60Co-γ诱变的群体中，发现了1份植株茎秆变脆的突变体，将其命名为bc1-wu3。经多代连续种植，突变体脆性表型能稳定遗传。2014年在扬州以籼稻品种Kasalath为父本与突变体bc1-wu3杂交获得F1，2014年冬季在海南种植F1及相应亲本，成熟期收获F1植株自交种子。2015年正季在江苏扬州种植组合bc1-wu3/ Kasalath的F2群体及对应亲本。

1.2表型鉴定

2015年正季将突变体bc1-wu3和野生型（WT）武育粳3号种植于扬州大学农学院实验基地，小区种植，3次重复，管理与一般大田相同。期间调查WT与突变体的生育期，并在全生育期期间田间观察突变体与野生型的脆性表型。成熟后随机从小区中央选取10株考查株高、分蘖数、结实率、千粒重、粒长和粒宽等性状。

1.3茎秆机械强度测定

水稻植株抽穗25 d后，在野生型和突变体小区中央各选取10株正常生长发育的植株，利用茎秆强度测定仪（浙江托普仪器有限公司，DYY-1型）测定主茎穗倒2节间茎秆的机械强度。

1.4细胞学观察

参考Song等[20]及蔡建秀等[21]的方法，利用扫描电镜（日本，S-3000N/Hitachi）观察及分析WT和突变体种子颖壳背面的细胞大小。抽穗后取发育时期相近的WT和突变体倒2节间中间部位2～4 mm小段，经2.5%戊二醛的PBS缓冲液4℃下固定48 h后再用1%锇酸溶液固定过夜。固定后的样品经PBS缓冲液漂洗，乙醇和丙酮脱水后依次用伦敦白胶树脂（London Resin White，Sigma公司）与乙醇以1∶3、1∶1和3∶1的体积比混合浸透，最后用纯树脂继续浸透48 h，并于模块中包埋，60℃下聚合24 h。样品修块后以80 nm超薄切片，放置于铜网上，观察前用醋酸铀和柠檬酸铅复染。样品在扫描电镜上观察。对不同切片样品的观察不少于2次，每次观察的细胞数量不少于10个。

1.5茎秆细胞细胞壁组分含量测定

水稻植株成熟后，随机从每个小区中央分别选取10株野生型和突变体，取倒2节间测定茎秆细胞细胞壁成分，参考Xiong等[9]的方法进行测定。

1.6分子标记开发及基因定位

利用混池法（bulked segregant analysis, BSA），在bc1-wu3/Kasalath衍生的F2分离群体中随机选取正常与脆秆单株叶片各10株混成2个池，采用CTAB法[20]提取水稻叶片基因组DNA。SSR 分子标记信息来源于Gramene(http：//www. gramene. org/)，InDel标记根据NCBI(http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/)数据库中提供的9311与日本晴序列差异开发，由上海生工生物技术有限公司合成（表1）。选取武育粳3号与Kasalath之间存在多态性的189对SSR分子标记扩增上述DNA，以获得连锁标记。PCR体系(20 μL)如下:模板DNA 1.0 μL，10×PCR缓冲液2.0 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，2 mmol/L dNTP 2.0 μL，0.3 μmol/L引物2.0 μL，Taq酶0.5 U，加ddH2O补足20 μL。PCR扩增条件如下:95℃下预变性5 min；94℃下变性40 s，50～60℃下退火40 s（温度因引物不同而异），72℃下延伸40 s，32个循环；72℃下延伸10 min，18℃下保温。PCR产物在3%琼脂糖凝胶中分离，经溴化乙锭染色后在凝胶成像仪（BIO-RAD公司，Gel DocTmXR+ imaging system）上成像。

表1 本研究中使用的PCR引物Table 1. PCR primers used in this study.

1.7候选基因分析

根据基因精细定位结果，查阅在水稻基因组注释数据库(http：//rice genome annotation project)相应区间内的所有开放阅读框(ORF)，分析可能的候选基因。根据候选基因全长基因组DNA序列，设计测序引物，分别对野生型和突变体的基因组进行扩增并测序。测序结果通过DNASTAR软件进行比对，确定突变位点。

1.8RT-PCR

利用天根公司的RNA提取试剂盒（RNA prep pure Plant Kit）提取武育粳3号及突变体bc1-wu3茎秆中的总RNA，并用TaKaRa公司的去除基因组逆转录试剂盒[Primer Scripttm RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)]反转录得到cDNA第一条链。利用实时荧光定量PCR分析bc1-wu3基因在武育粳3号及突变体bc1-wu3茎秆中的表达量。用内参基因Actin进行归一化处理，利用2-ΔΔCT法计算相对表达量。实验所用试剂为TaKaRa公司的定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex TaqTM)，所用仪器为CFX96实时 PCR仪（BIO- RAD公司生产）。实时qPCR体系包括cDNA模板2 μL、SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μL、正反向引物各0.4 μL（终浓度0.2 μmol/L）、ddH2O补足20 μL。每个样品生物学重复3次，技术性重复3次。PCR扩增采用两步法，程序如下:95℃下30 s；95℃下5 s，60℃下30 s，39个循环。溶解曲线分析:95℃下10 s，65℃下5 s，95℃下5 min。

1.9数据分析

利用SPSS软件对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1突变体表型特征及农艺性状分析

在大田生长条件下，与野生型相比，突变体bc1-wu3的株型变化不明显（图1-A），但其叶片、叶鞘、茎秆在整个生育期均表现出脆性（图1-B、C）；bc1-wu3的穗长、粒长均显著降低，较野生型分别降低了10.80%和1.97%；粒宽显著增加，增加比例为6.34%(图1-D、E、F， 表2)；突变体其他性状，如抽穗期、株高、分蘖数、结实率和千粒重等与WT无显著差异 （表2）。利用扫描电镜观察WT和突变体种子的颖壳，结果表明，突变体种子颖壳背面细胞的宽度较WT显著增加，而细胞长度则显著缩短，表明突变体种子颖壳细胞大小的变化引起突变体粒型发生相应变化（图2）。

图1 野生型(WT)与突变体bc1-wu3表型的比较Fig. 1. Comparison of the phenotypes between wild type(WT) and bc1-wu3.

表2 野生型(WT)和突变体bc1-wu3的农艺与产量性状Table 2. Agronomic and yield traits of wild type(WT) and bc1-wu3.

2.2突变体茎秆机械强度测定及茎秆横切面细胞学观察

茎秆机械强度测定结果表明，突变体bc1-wu3的茎秆机械强度较野生型下降79.32%，呈现极显著差异（图3）；茎秆横切面细胞学观察结果表明，突变体茎秆的厚壁细胞层数较野生型减少（图4-A～B），厚壁细胞细胞壁极显著变薄（图4-C～E）。以上结果表明，茎秆细胞形态上的变化，特别是厚壁细胞层数的减少及厚壁细胞细胞壁变薄会降低水稻茎秆的机械强度。

2.3突变体茎秆细胞细胞壁中糖组分含量分析

茎秆细胞细胞壁糖组分含量测定结果表明(表3)，突变体bc1-wu3茎秆细胞细胞壁中纤维素含量较WT呈现极显著下降，下降比例为38.77%；木糖、葡萄糖及阿拉伯糖含量则显著增加，增加比例分别为42.86%、21.11%和26.21%；其他中性糖的含量变化幅度较小，差异不显著。

2.4突变体脆秆性状的遗传分析及基因精细定位

Kasalath与突变体bc1-wu3配置的F1植株表型正常，F2群体出现明显的表型分离，其中正常株3014株，脆性株987株。经卡方测验，正常株与脆性株符合3∶1分离比（χ2=1.24＜χ20.05,1=3.84）, 结果说明突变体bc1-wu3脆性性状受1对隐性核基因控制。

图2 野生型(WT)与突变体bc1-wu3种子颖壳细胞形态的比较Fig. 2. Comparison of the size of grain glume cell between wild type(WT) and bc1-wu3.

表3 野生型(WT)与突变体bc1-wu3茎秆细胞细胞壁中糖组分含量比较Table 3. Comparison of the sugar composition contents of culms between wild type(WT) and bc1-wu3. mg/g

图3 野生型(WT)和突变体bc1-wu3的茎秆机械强度Fig. 3. Culm strength of wild type(WT) and bc1-wu3.

为定位该脆性基因，利用均匀分布于水稻12条染色体上的380对SSR标记及STS标记，筛选出189对在bc1-wu3与Kasalath之间显示多态性的标记。利用上述多态标记，运用BSA法对该基因进行连锁分析。结果表明(图5)， bc1-wu3基因与第3染色体上的标记RM6676和STS3-86.6连锁。利用94株脆性单株验证了这两对标记，且在RM6676处检测到2个交换单株。在标记STS3-86.6处检测到1株交换单株，由交换单株信息可知，该基因位于这2对标记之间。随后利用这2对标记对893株F2脆性单株进行检测，在标记RM6676处找到13株交换单株，在标记STS3-86.6处找到10株交换单株。为进一步精细定位该基因，在标记RM6676与STS3-86.6之间设计了15对InDel标记，其中有5对标记在bc1-wu3与Kasalath之间显示出多态（表1）。利用这5对标记和26株交换单株，最终将突变基因bc1-wu3定位于InDel标记MK12与MK18之间，物理距离为57 kb。根据水稻基因组注释数据库信息，这一区段位于日本晴克隆AC120538上(图5)。

图4 野生型(WT)和突变体bc1-wu3茎秆细胞结构Fig. 4. Scanning electron micrographs of the culm phenotype of wild type(WT) and bc1-wu3.

图5 bc1-wu3基因精细定位及候选基因序列分析Fig. 5. Fine mapping of bc1-wu3 gene and sequence analysis of the candidate gene.

图6 BC1基因在水稻茎秆中的表达量Fig. 6. Expression analysis of the BC1 gene in culm of rice.

2.5候选基因预测

根据水稻基因组注释数据库注释信息可知，InDel标记MK12与MK18之间包含10个开放阅读框(LOC_Os03g30220～LOC_Os03g30300)，该区段内包含1个已克隆的与细胞壁合成相关的基因BC1(BRITTLE CULM1)[17]，BC1基因突变导致茎秆机械强度降低。基于此，首先对该基因的ORF进行测序(表1)。测序结果表明，突变体bc1-wu3中该基因在第2外显子内(CDS 659处)有1个碱基的替换(G-T)，引起编码的氨基酸由半胱氨酸(Cysteine)变为苯丙氨酸(Phenylalanine)(图5)。由 RT-PCR结果可知，突变体bc1-wu3茎秆中BC1基因的表达量比野生型显著低(图6)。因此，我们推测bc1-wu3基因为BC1的新等位基因。

3 讨论

水稻茎秆的机械强度作为水稻的重要农艺性状，直接关系到水稻的产量[23]。已有研究表明，控制水稻茎秆机械强度的机制复杂，任何一种细胞壁成分上的改变或者调节因子的变化都会直接或间接地影响茎秆的机械强度[3-4,24]。目前，一系列脆秆基因的克隆对揭示水稻控制茎秆机械强度的遗传机制起了重要的作用，但其遗传机制还有待进一步完善[25]。

目前报道的脆性突变体可分为两类，第一类是脆秆突变体，表现为茎秆、叶片、叶鞘等器官的机械强度降低，如突变体bc1、bc3、bc6、bc7、bc12、 bc14、bc15等，第二类为脆节突变体，其只在叶和茎的发育节点上表现出脆性，茎秆和叶片等组织的机械强度并没有发生显著变化，如bc5[27]。脆秆突变体往往会伴随着其他农艺性状的改变，如bc10、bc11、bc12、bc14、cef1、dwf1[28]、fld1等，这些突变体均表现出植株矮化，小穗育性降低等；bc10、bc6、bc88、dwf1等突变体的分蘖数均显著下降；突变体dwf1的千粒重极显著下降。但在脆秆突变体中也有除了茎秆强度降低外，其他主要农艺性状没有明显变化，如突变体bc1、bc15。本研究中，突变体bc1-wu3的茎秆、叶片、叶鞘等组织的机械强度极显著下降，是一个典型的脆秆突变体。相比其他脆秆类突变体，bc1-wu3基因除了引起植株茎秆的机械强度极显著降低外，还引起突变体的穗长、粒长和粒宽的变化,有趣的是粒型变化并没有引起籽粒千粒重改变。扫描电镜结果表明，bc1-wu3突变体颖壳细胞大小的改变引起籽粒的长和宽的改变。类似粒型的变化之前没有报道，相关研究结果丰富了对脆秆基因功能的认识。

遗传分析及RT-PCR结果表明，bc1-wu3基因为BC1基因的新等位基因。目前已报道的BC1基因的等位基因有2个[17]，这两个突变体与本研究中鉴定的突变体bc1-wu3相比，在脆性表型上存在差异，虽然三者茎秆机械强度均降低，但突变体bc1-wu3茎秆机械强度降低更明显，降低比例为79.32%。就BC1基因而言，3个突变体中BC1基因变异位点不同，突变体bc1-1中，发现在425处密码子中有一个单碱基(T)插入(TTC→TTTC)，产生a+1的移码突变；bc1-101等位基因突变则是由于第1外显子236和237密码子处有4个碱基的缺失(AGGTGC→AC)，这个缺失引起了移码突变，从而导致在292密码子处产生终止密码子，这两类突变均导致氨基酸链长度发生改变；而bc1-wu3中突变形式仅为1个氨基酸的替换，氨基酸链的长度没有变化，说明该突变位点为BC1基因发挥功能的重要位点。虽然Liu等[26]已对BC1参与纤维素合成的作用机制及水稻次生壁形成的转录调控机理进行了研究，但并没有报道该位点。因此，该位点在BC1基因发挥功能时起何种作用有待进一步研究。同时本研究发现尽管突变体中bc1-wu3基因编码的氨基酸链长度没有变化，但其茎秆机械强度却变化最明显，推测原因可能是由于突变体背景不同引起的。

脆秆突变体除了可作为研究植物控制茎秆机械强度机制的遗传材料外，还可以直接用于谷秆两用性特种稻的选育[29]。已有研究表明，脆性水稻与一般水稻相比更有利于微生物快速附着和降解，利于饲养动物对食物的消化和吸收，对改善饲养动物肌肉品质有重要作用[30-31]。吴超等[32]已从水稻转基因的材料中选出了2个适合作为谷秆两用特种稻的育种材料，为谷秆两用特种水稻选育工作提供了重要的亲本。但是脆秆水稻在直接利用中会出现一些问题，如因叶片、叶鞘、茎秆等组织的机械强度的降低，使得人工拔秧时秧苗易折断，因此会增加用种量；收割时籽粒容易脱离，产量容易损失等[27]。因此，选育适当脆性材料是实现谷秆两用型特种稻的选育成功的关键。本研究中定位的脆性基因bc1-wu3可为选育谷秆两用型水稻提供分子理论基础。总之，脆秆突变体不论是在研究水稻茎秆的机械强度遗传机制上还是水稻生产利用中均有较大的应用空间。

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Identification and Gene Cloning of the Brittle Culm Mutant bc1-wu3 in Rice

XU Zuopeng, ZHONG Chongyuan, ZHANG Lijia, LIU Qiaoquan*
(Key Laboratory of Plant Functional Genomics, Ministry of Education / Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops, College of Agriculture, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China；*Corresponding author, E-mail： qqliu@yzu.edu.cn)

【Objective】Culm strength, an important agronomic trait, is related to lodging resistance of rice. The research of brittle culm mutants and genes has great significance to demonstrate the regulation of genetic mechanism of culm mechanical strength and breed lodging resistance varieties.【Method】In this study, a brittle culm mutant, named bc1-wu3(brittle culm 1 from Wuyujing 3), was obtained from the japonica variety Wuyujing 3 after60Co-γ induced mutagenesis. F2population derived from bc1-wu3/Kasalath was used to mapping this corresponding gene by position cloning approach.【Result】The mutant was characterized by the brittle leaf, leaf sheath, and culm during the whole growing stage. Compared with the wild type, the panicle length and grain length of bc1-wu3 decreased significantly, and the grain width presented a significant increase. There was a significant decrease in the cellulose content in culm, the number of sclerenchyma cell layers and the thickness of sclerenchyma cell wall, but the contents of xylose, glucose and arabinose increased significantly in bc1-wu3. Genetic analysis showed that the brittle trait in bc1-wu3 was controlled by one single recessive nuclear gene, and the locus was mapped to a 57 kb genomic region on chromosome 3 between molecular markers M12 and Mk18. In the mapped region the cloned brittle culm gene BC1(LOC_Os03g30250) was included, which might be the candidate gene of bc1-wu3. Sequence analysis revealed that there was a single-base substitution(G-T) in the second exon of BC1 gene in bc1-wu3 mutant, leading to a residue substitution from cysteine to phenylalanine. The data from real-time RT-PCR indicated that there was significant decrease in the expression of BC1 gene in the culm of the mutant. 【Conclusion】Based on these results，we speculate that the bc1-wu3 gene is allelic to BC1 gene. These results would deepen our understanding for the function of BC1and help us to clarify the genetic mechanisms of culm strength.

Oryza sativa L.; brittle culm mutant; BC1 gene; genetic analysis; gene mapping

Q343.5; S511.01

A

1001-7216(2017)02-0157-09

2016-09-30；修改稿收到日期:2016-11-10。

国家转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX08009-024B)；国家自然科学基金资助项目(31561143008)；江苏省高校“青蓝工程”项目。