干湿交替诱导水稻根表铁膜形成的基因表达谱分析

傅友强于晓莉杨旭健沈宏*

研究报告

干湿交替诱导水稻根表铁膜形成的基因表达谱分析

傅友强1,2于晓莉1杨旭健1沈宏1,*

（1华南农业大学 资源环境学院，广州 510642；2广东省农业科学院 水稻研究所，广州 510640；*通讯联系人，E-mail： hshen@scau.edu.cn）

【目的】干湿交替（AWD）是水稻种植过程中最重要的管理方式，能够提高水稻根系活力、增强抗逆性。研究发现，AWD能明显促进水稻根表铁膜的形成。然而，AWD诱导水稻根表铁膜形成的基因表达谱尚未见报道。【方法】采用砂培试验，研究了长期淹水（CK）、干湿交替（AWD）、长期淹水加Fe2+（CK+Fe）和干湿交替加Fe2+（AWD+Fe）四个处理下水稻根系基因的差异表达谱。【结果】AWD处理与CK处理相比，水稻根系有506个差异表达基因（DEG）上调表达，有687个DEG下调表达；AWD+Fe处理与CK+Fe处理相比，有308个DEG上调表达和179个DEG下调表达；CK+Fe处理与CK处理相比，有728个DEG上调表达和1175个DEG下调表达；AWD+Fe处理与AWD处理相比，有1252个DEG上调表达和1189个DEG下调表达。维恩图分析发现，共计有3822个DEG参与了AWD诱导水稻根表铁膜形成过程。基因功能（GO）分析表明，在生物过程中共有270个DEG参与了氧化还原反应过程，分子功能中共有165个DEG与氧化还原酶功能有关。生物通路富集分析（KEGG）结果表明，细胞器类、信号刺激类、光合作用类、生物合成类和代谢类等生物通路参与了AWD诱导水稻根表铁膜的形成过程。AWD和根表铁膜形成过程发现有38个共享DEG，这些基因的蛋白注释与水稻抗病性、抗旱性、细胞壁和细胞膜、氧化还原、蛋白激酶和转运、新陈代谢过程有关。与CK处理相比，AWD处理诱导了氧化还原反应过程相关的基因达102个，占总DEG数的8.25%。AWD处理促进了水稻根系过氧化物酶、脂肪酸氧化酶和乙醇酸氧化酶等相关基因的上调表达。与CK处理相比，AWD处理提高了水稻根系活力和根表铁膜数量，分别为22.9%和45.7%。实时荧光定量PCR验证结果与转录组分析结果基本一致，其相关系数达到0.90。【结论】综上所述，AWD明显诱导了氧化还原反应过程中的相关基因大量表达，增加了根系氧化力，促进根表铁膜的形成；过氧化物酶、脂肪酸氧化酶和乙醇酸氧化酶等相关的基因可能是AWD诱导水稻根表铁膜形成的重要基因。

水稻；干湿交替；铁膜；差异表达基因；氧化还原相关基因

稻田干湿交替灌溉处理有利于土壤氧化和还原状态的交替进行[1]，进而提高土壤氧化还原电位，改善土壤的通气性，协调土壤水分与O2之间平衡，节约灌溉用水和提高水分利用率[2]。同时，干湿交替灌溉处理增加土壤细菌、放线菌的活性和数量，促进水稻根系的生长[3]，从而提高水稻产量和品质。因此，稻田进行干湿交替灌溉处理是水稻生产过程中最常见的管理措施，对促进水稻生长发育和产量的提高起着非常重要的作用。有研究表明，干湿交替灌溉处理能够提高水稻自身的根系氧化力[4]。提高水稻根系抗氧化酶系统如超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性[5]，与对照相比，根系氧化力增加了180%[6]。因此，根系氧化力和根系抗氧化酶活性的提高是根系响应干湿交替灌溉处理的直接体现[7]。然而，干湿交替处理提高水稻根系氧化力的分子机理很少报道。有研究表明，根系抗氧化酶活性和根系氧化力的提高是水稻根表铁膜形成的重要影响因素[8,9]。钟顺清[10]研究发现，形成铁膜后的水稻根系活力与根表铁膜数量呈显著负相关。因此，干湿交替具有提高水稻根系氧化力进而诱导水稻根表铁膜形成的能力。然而，这一过程的内在分子机理并不清楚。

随着生物技术水平的提高，基因表达谱分析、基因芯片分析和全基因组分析等的出现，对挖掘新的基因响应非生物胁迫提供了技术支撑[11]。有研究表明，基因表达谱分析对解析基因的生物功能具有非常重要的作用，基因的差异表达为重新创造新的表型差异提供了新证据。如Ⅲ型转氨酶基因在植物生长、发育和响应非生物胁迫过程中扮演着非常重要的角色[12]；P-型Ca2+ATP酶基因参与了水稻花粉管的生长发育、营养生长、花序结构、气孔开度和Ca2+、Mn2+、Zn2+的运输[13]；蛋白磷酸酶是一种非常重要的信号通道组分，参与许多非生物胁迫响应和植物的生长与发育过程。目前共识别132个蛋白磷酸酶基因，都能被非生物胁迫和植物生长发育所诱导[14]。其次，同一基因家族不同成员在逆境胁迫条件下表达丰度也存在明显差异。如Ray等[15]研究发现，依赖钙的蛋白激酶在调控作物生长发育和响应下游钙信号途径中发挥着重要作用。在非逆境胁迫下，有31个依赖钙的蛋白激酶基因被识别，其中，环境胁迫条件下有6个依赖钙的蛋白激酶基因被诱导，1个依赖钙的蛋白激酶基因被下调表达。此外，非生物胁迫如冷害、干旱和盐害胁迫也会诱导大量基因的差异表达，许多关键功能和调控基因参与了非生物胁迫过程[16]。如在盐胁迫条件下，发现了成千上百个基因差异表达[17]；盐害、干旱和冷害会诱导miRNA的差异表达，调控着植物生长发育，如miR168、miR171和miR396等[18]；Jangam等[19]研究冷胁迫、干旱胁迫、热胁迫和盐胁迫条件下水稻品种RGA1（异源三聚体的G-蛋白突变体）的基因差异表达情况，发现冷胁迫条件下有878个上调基因和810个下调基因响应，干旱胁迫有882个上调基因和837个下调基因响应，热胁迫有913个上调基因和777个下调基因响应，盐胁迫有889个上调基因和841个下调基因响应。由此可见，在非生物胁迫中有大量基因参与响应。要了解非生物胁迫忍耐机制，关键功能和调控基因的识别是非常重要的分子基础[16]。然而，对干湿交替和根表铁膜形成过程中水稻根系差异基因表达谱的研究很少报道。因此，本研究运用基因转录组分析干湿交替和水稻根表铁膜形成过程中的差异表达基因，希望进一步了解水稻根系中哪些基因可能参与水稻根系氧化力提升，进而促进水稻根表铁膜数量的增加，以期阐明干湿交替条件下，水稻根表铁膜形成的分子机理。

1 材料与方法

1.1试验材料与植株培养

水稻材料为感温型常规稻品种华航丝苗。挑选饱满的水稻种子于30℃下进行催芽处理，3 d后将幼苗转移到1/2剂量的完全营养液中，培养4 d后，转移至10 L的塑料箱中用完全营养液进行培养。每个塑料箱移植48株，当幼苗长到3叶1心时转移于装有3 kg石英砂的干湿交替装置中（图1），每个装置栽种3株水稻苗，7 d换一次营养液。上述所有溶液pH值都用盐酸或氢氧化钠调到5.5。

图1 干湿交替装置Fig. 1. Device of alternate wetting and drying (AWD).

干湿交替装置由大小两个塑料盆和一个塑料垫组成，各部件的尺寸如图1所示。小的塑料盆底下有6个直径为1 cm的圆孔，允许营养液在大小两盆间自由流通。试验用砂由＞2 mm、1～2 mm和＜1 mm三种粒径范围的石英砂按质量比1∶2∶2混合而成，石英砂装在小盆中。落干处理时，将塑料垫放入大盆内，将小盆垫高，使小盆底部脱离液面，小盆石英砂中的营养液就会从底部圆孔流入大盆，并贮存于大盆中，实现了水稻落干过程；淹水处理时，将塑料垫从大盆中拿出，使小盆浸入装有营养液的大盆中，实现淹水过程，淹水状态时始终保持水面在石英砂表面以上2～3 cm的位置。如此往复1次，称为1个干湿交替周期，该装置能够人为实现定时定量干湿交替处理。

完全营养液配方在Yoshida等[20]的基础上稍做修改，具体如下:NH4NO30.429 mmol/L，Ca(NO3)2·4H2O 1 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.667 mmol/L，KH2PO41 mmol/L，K2SO40.513 mmol/L；Fe(Ⅲ)-EDTA 50 μmol/L，MnSO49.1 μmol/L，ZnSO40.15 μmol/L，CuSO40.16 μmol/L，H3BO319 μmol/L，(NH4)4MoO24·4H2O 0.52 μmol/L。

磷铁比（磷酸根与铁离子的物质的量浓度之比, P/Fe）为1/6的营养液是在1/2剂量的完全营养液的基础上将KH2PO4改成0.05 mmol/L，K2SO4改为0.357 mmol/L，补充0.3 mmol/L FeSO4·7H2O，使得P/Fe为1/6，其他组分不变。该磷铁比有利于形成更多的红棕色铁膜[21]。

1.2试验设计

培养21 d的水稻幼苗进行如下处理:1）CK，对照；2）AWD，干湿交替5次；3）CK+Fe，对照处理的水稻幼苗在磷铁物质的量比为1∶6（P:0.05 mmol/L；Fe2+:0.3 mmol/L）的营养液中处理；4）AWD+Fe，干湿交替处理5次的幼苗在磷铁物质的量比为1∶6的营养液中处理，其中，干湿交替处理以落干12 h/淹水12 h为一个干湿交替周期（定义为干湿交替1次）。2 d后，分别取根系基部0～5 cm的水稻根系进行RNA提取。采用Omegara E. Z. N. A®植物RNA提取试剂盒提取总RNA，纯化后，用1.5%琼脂糖凝胶在135 V电压下电泳20 min检测条带的亮度，并利用Agilent 2200 生物分析仪分析RNA浓度及完整性，提取和纯化的RNA可进行后续基因差异表达谱和生物信息分析。首先，将合格的水稻根系RNA进行RNA片段化处理，然后打断成不同大小片段的RNA，进行随机反转录合成cDNA文库。连接测序接头扩增，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，并进行PCR扩增，从而完成整个文库制备工作，构建好的文库用HiSeq™2000测序仪(Illumina，美国)进行测序。测序策略为SE：1X50.bp测序。转录组测序得到的数据为原始数据（raw data），首先需要对这些数据进行过滤，获得高质量数据(clean data)。并将这些高质量数据与参考基因组(水稻籼稻基因组，http：//ensembl. gramene.org/Oryza_indica/ Info/Index?)进行比对，得到BAM文件。根据差异倍数(|Fold change|＞2)和显著水平(q值＞0.05)，计算基因表达量和分析样品间差异表达基因，并对差异基因进行GO和KEGG分析。

1.3试验方法

1.3.1 引物设计

从AWD与CK相比的数据库中与氧化还原相关的上调表达基因中随机选取6个差异表达基因，再从共同响应干湿交替和铁膜形成的38个差异表达基因中随机选取3个差异表达基因，即共选取9个差异表达基因利用水稻籼稻参考基因组数据库(http：//ensembl.gramene.org/Oryza_indica/Info/Index)查询各基因的编码区序列。利用Primer Premier 6.0引物设计软件进行荧光定量PCR正反引物的设计。通过网络在线网站(http：//biotools.nubic. northwestern.edu/OligoCalc.html）进行引物发夹结构的检验和NCBI中的Primer-BLAST (http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi? LINK_LOC=BlastHome）进行引物特异性的验证。引物设计如表1。

1.3.2 水稻根系总RNA提取和反转录cDNA

用去离子水清洗水稻根系，根表水分用纸巾吸干，将一定量的根系于液氮中抽提RNA，采用Omegara E.Z.N.A.®植物RNA提取试剂盒提取水稻根系总RNA[22]。用微量分光光度计分别检测RNA在260 nm和280 nm处的光度值，以保证RNA的纯度和浓度。采用TaKaRa PrimeScript®反转录PCR试剂盒进行反转录获得cDNA。随后，将cDNA反应液放入-20℃冰箱中备用。

1.3.3 实时荧光定量PCR的测定

将所得到的反转录cDNA稀释50倍作为模板（0.5 μg RNA反转录）。每个样品取适量cDNA稀释5倍作为标准曲线模板的最大点，随后按10倍的稀释梯度作标准曲线模板，采用无RNA酶纯水作标准曲线模板的零点。用目的基因和内参基因的引物进行荧光定量PCR。分别采用表1中特异性引物在荧光定量PCR仪器（RG3000）上进行实时荧光定量PCR。扩增条件如下:98℃下预变性10 min；98℃下变性15 s，60℃下退火1 min，扩增循环数为40个。用实时荧光分析软件6.0计算样品表达量。相对表达量为目的基因表达量与内参基因表达量的比值。

表1 实时荧光定量PCR引物Table 1. Primers of quantitative real-time PCR.

1.3.4 水稻根表铁膜的测定

水稻根表DCB-Fe采用DCB法稍加修改进行提取[23]，即水稻根系用去离子水冲洗干净，放入150 mL的三角瓶中，加入0.03 mol/L Na3C6H5O7·2H2O 40 mL，0.1 mol/L NaHCO35 mL及Na2S2O41 g，于25℃下在150 r/min的摇床上振动3 h，溶液转移至100 mL容量瓶中定容。

DCB浸提液中的铁用原子吸收分光光度计（型号:日立Z-5300，日本）测定。植物根表铁膜数量（厚度）采用g/kg（根干质量）表示。

表2 数据过滤统计分析Table 2. Statistical analysis of data filtering.

1.3.5 根系活力的测定

根系活力的定量测定根据Ramasamy等[24]的方法，略有修改:将处理完后的水稻根系用自来水冲洗，去除水稻幼苗的地上部，根系用去离子水冲洗3次，然后用滤纸吸去根系表面的水分，将根系放入100 mL三角烧瓶中。加50 μg/mL的α-萘胺溶液与pH7.0磷酸缓冲液各25 mL，用玻璃棒将根系全部浸入溶液中，轻轻振荡，静置10 min。吸取2 mL溶液，测定α-萘胺含量，作为试验开始时的数值。另外，不放根系的空白处理同时进行，作为α-萘胺的自然氧化值。

样品在25℃下以150 r/min恒温振荡3 h，吸取2 mL溶液，加入10 mL去离子水，随后加入1%对氨基苯磺酸溶液1 mL和亚硝酸钠溶液1 mL，在室温中放置5 min，待混合液变成红色，再用去离子水定容到25 mL。在20～60 min内于510 nm下读取吸光度，通过标准曲线计算相应的α-萘胺浓度。从试验开始（10 min）时的数值减去自动氧化的数值，即为溶液中所有的α-萘胺量，再减去试验结束时α-萘胺含量，即得试验期间根系所氧化的α-萘胺量。被氧化的α-萘胺量以μg/（g·h）表示。

1.4统计分析

本研究所有数据在SPSS 13.0软件上采用Turkey (P＜0.05)法进行单重比较，根据所得数据平均值和标准误，用OriginPro 9.0软件作图，并用不同字母表示不同处理间差异显著水平。

2 结果与分析

2.1水稻根系RNA质量评估

依据原始数据的分析结果对数据进行过滤，去除接头序列和污染部分；再去除含有过多N碱基（＞10%，N碱基为仪器不能辨读的碱基）及含有过多低质量碱基（质量值低于20的碱基占整条序列的20%以上）的序列。所得数据产生了超过6.73 G的50 nt单末端序列数据库。整个过程接头污染不到0.3%，过多的N序列不到0.05%，低质量序列不到1.7%，得到6.56 G的干净数据，Q20都大于98%（表2）。说明数据过滤后的质量非常可靠，可进行下一步的质量统计。

表 3 Reads比对结果统计Table 3. Alignment result statistics of Reads.

2.2碱基序列比对

我们使用tophat进行序列比对，参数为: read-mismatches=2(允许2个错配)，readgap-length=2（允许2个gap）。将测序数据与参考基因组进行比对，对数据测序覆盖区域、测序数据覆盖深度等做出综合评价。结果发现，12个样品中总的Reads数范围达到0.13亿～0.18亿条，总的碱基数达到6.5亿～9.0亿个，基本覆盖了水稻全部基因组序列。通过去掉多序列比对的结果，单序列比对率都大于82%，且比对基因组中正负链基本相似，表明了碱基序列匹配的准确性（表3）。

2.3干湿交替诱导水稻根表铁膜形成的差异表达基因分析

水稻幼苗通过砂培方式培养21 d后，进行如下4个处理:CK，长期淹水处理（对照）；AWD，干湿交替5次处理；CK+Fe，对照水稻幼苗在P/Fe（磷酸根与铁离子的物质的量浓度之比）为1∶6的溶液中处理2 d；AWD+Fe，干湿交替处理的幼苗在P/Fe为1∶6的溶液中处理2 d，然后进行基因表达谱分析。如图2所示，AWD处理与CK处理相比，水稻根系有506个基因上调表达，有687个基因下调表达；AWD+Fe处理与CK+Fe处理相比，根系上调表达基因有308个，下调表达基因有179个；CK+Fe处理与CK处理相比，根系上调表达基因有728个，下调表达基因有1175个；AWD+Fe处理与AWD处理相比，根系上调表达基因有1252个，下调表达基因有1189个。

利用网络在线工具（http：//genedenovoweb. ticp.net：81/gdtools/login.php）将图3-A、B、C和D 4个数据库进行维恩图分析，发现共有3 822个差异表达基因参与了干湿交替诱导水稻根表铁膜的形成过程。其中，有90个基因共同受干湿交替处理（AWD vs CK 和AWD+Fe vs CK+Fe）诱导；有869个基因共同受Fe2+（CK+Fe vs CK和AWD+Fe vs AWD）诱导（图3）。重要的是，38个差异表达基因共同受干湿交替和铁膜形成诱导。

图2 水稻根系4个数字基因表达库Fig. 2. Four digital gene expression libraries of rice roots.

图3 差异表达基因数目在维恩图中的分布情况Fig. 3. Distribution of differentially expressed genes in the Venn diagram.

图4 GO功能分类Fig. 4. GO classification.

2.4差异表达基因的GO分析

Gene Ontology分析即GO分析，可分为分子功能（Molecular function）、生物过程（Biological process）和细胞组成（Cellular component）三个部分，它常用于提供基因功能分类标签和基因功能研究的背景知识。通过物种和基因信息，用GO数据库进行查找，从而得到基因GO的注释信息（功能信息）。首先，将中4个数据库中的差异表达基因共3822个分离出来，然后进行整体GO分析（图4）。结果发现，从生物过程来看，有8个主要的生物过程，分别为新陈代谢过程（metabolic process）、氧化还原过程（oxidation-reduction process）、转录调控过程（regulation of transcription）、电子传递（electron transport）、蛋白磷酸化过程（protein phosphorylation）、蛋白水解过程（proteolysis）、氧化胁迫的响应过程（response to oxidative stress）和盐胁迫的响应过程（response to salt stress）。有趣的是，除了新陈代谢过程外，有270个与氧化还原过程相关的差异表达基因响应干湿交替诱导根表铁膜的形成过程。从细胞组成来看，主要有9个细胞组成，分别为细胞膜（membrane）、叶绿体（chloroplast）、线粒体（mitochondrion）、质体（plastid）、细胞壁（cell wall）、细胞核（nucleus）、转录因子复合体（transcription factor complex）、液泡（vacuole）、质外体（apoplast），其中大部分差异表达基因主要定位在细胞膜上。从分子功能来看，主要有9个分子功能，分别为绑定酶活（binding）、氧化还原酶活性（oxidoreductase activity）、水解酶活性（hydrolase activity）、丝/苏氨基蛋白激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）、转录因子酶活性（transcription factor activity）、电子传递活性（electron carrier activity）、过氧化物酶活性（peroxidase activity）、二聚体蛋白活性（protein dimerization activity）和单氧酶活性（monooxygenase activity），其中大部分差异表达基因主要参与分子绑定酶活功能。值得注意的是，除了绑定酶活功能外，有165个与氧化还原酶活性相关的基因响应干湿交替诱导水稻根表铁膜的形成过程。

图5 基于KEGG的不同差异表达基因的通路分布Fig. 5. Pathway assignment of differentially expressed genes based on KEGG analysis.

2.5差异表达基因的KEGG分析

从复杂调控网络的角度出发，根据KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）生物学通路数据库(http：//www.genome.jp/)，对差异基因进行生物通路富集分析，从而提取出最相关的生物通路上的差异基因，更加有利于下游试验的开展。从图5可知，4个数据库共3 822个差异表达基因主要参与33条通路。对这些通路进行归纳总结和分析。结果发现，33条KEGG通路大致可分成5大类，即细胞器类、信号刺激类、光合作用类、生物合成类和代谢类。其中细胞器类主要有3条通路，即过氧化物酶体通路（peroxisome）、溶酶体通路（lysosome）、核糖体通路（ribosome）；信号刺激类主要有2条通路，即植物激素信号转导通路（plant hormone signal transduction）和植物与病原菌交互作用通路（plant-pathogen interaction）；光合作用类主要有3条通路，即光合作用通路（photosynthesis）、光合天线蛋白通路（photosynthesis-antenna proteins）和碳固定通路（carbon fixation in photosynthetic organisms）；生物合成类主要有7条通路，分别为次生代谢生物合成通路（biosynthesis of secondary metabolites）、抗生素生物合成通路（biosynthesis of antibiotics）、苯丙烷生物合成通路（phenylpropanoid biosynthesis）、氨基酸生物合成通路（biosynthesis of amino acids）、萜类化合物生物合成通路（terpenoid backbone biosynthesis）、黄酮类生物合成通路（flavonoid biosynthesis）和不饱和脂肪酸生物合成通路（biosynthesis of unsaturated fatty acids）。而代谢类通路最多，达到了18条，其中最重要的两条通路是新陈代谢通路（metabolic pathways）和不同环境条件下的微生物新陈代谢通路（microbial metabolism in diverse environments）。上述结果表明了细胞器类、信号刺激类、光合作用类、生物合成类和代谢类等通路都参与了干湿交替诱导水稻根表铁膜的形成过程。

2.6共响应干湿交替和根表铁膜的38个差异表达基因分析

将共同受干湿交替和根表铁膜形成诱导的38个差异表达基因根据NR数据库（non-redundant，非冗余蛋白质序列数据库）进行基因的蛋白注释。所注释的蛋白，可归纳为7大类(表4)，分别为抗病性类(2个)、抗旱性类(4个)、细胞壁和细胞膜类（8个）、氧化还原类(5个)、蛋白激酶和转运类(5个)、新陈代谢类(10个)及其他(4个)。同一类型不同基因的表达水平存在明显差异。对于抗病性类而言，与对照相比，干湿交替有利于病原菌相关蛋白基因上调表达，例如BGIOSGA033475-TA，它随着根表铁膜的形成，表达量逐渐增加。而植物抗病响应基因如BGIOSGA032127-TA，其表达量与BGIOSGA033475-TA呈现相反的趋势。对于抗旱性类而言，干湿交替处理都能降低疏水相关蛋白和对脱水响应的元件结合蛋白基因的下调表达，从而提高水稻抗旱性（表4）。对于水稻细胞壁和细胞膜类而言，干湿交替诱导了葡聚糖水解酶基因BGIOSGA005143-TA的上调表达，下调了糖基水解酶BGIOSGA019479-TA基因的表达，同时下调了与细胞壁纤维素蛋白基因BGIOSGA012450-TA、微纤维素蛋白基因BGIOSGA012450-TA和微管蛋白基因BGIOSGA009910-TA的表达，细胞壁的结构蛋白基因BGIOSGA031806-TA也明显下调表达。其次，细胞膜蛋白基因如BGIOSGA033296-TA和BGIOSGA025169-TA基因也下调表达，从而改变了细胞壁和细胞膜的结构和生理生化特性。根表铁膜的形成改善了细胞壁的结构蛋白基因和细胞膜蛋白基因。对于氧化还原类而言，除了乙醇酸氧化酶基因BGIOSGA017163-TA外，干湿交替处理都下调其他4个氧化还原酶基因的表达。除了异黄酮还原酶蛋白基因外，根表铁膜的形成都促进了其他氧化还原酶基因的下调表达。对于蛋白激酶和转运类而言，5个蛋白激酶和转运蛋白基因在干湿交替处理条件下都下调表达，而根表铁膜的形成都能改善蛋白激酶和转运蛋白基因的表达。对于新陈代谢类而言，不管是单独干湿交替处理还是干湿交替诱导的根表铁膜形成过程，与氧结合蛋白基因BGIOSGA012186-TA、光捕捉蛋白基因BGIOSGA003133-TA和肽酶C1A蛋白基因BGIOSGA015910-TA都能上调表达。除了NAD(P)(+)绑定蛋白基因BGIOSGA026338-TA和谷胱甘肽S转移酶蛋白基因BGIOSGA031475-TA都能在AWD和AWD+Fe处理中下调表达外，其他蛋白基因如晚期胚胎发育蛋白基因BGIOSGA033178-TA、肽酶蛋白基因C13 BGIOSGA017447-TA、C1A蛋白基因BGIOSGA016118-TA、类似叶绿体核DNA绑定蛋白酶BGIOSGA023256-TA和类似乙醛酸转氨酶蛋白基因BGIOSGA010778-TA在AWD中都下调表达，而AWD+Fe处理改善了这些蛋白基因的表达水平。有趣的是，我们还发现了3个假设蛋白基因，分别为BGIOSGA033067-TA、BGIOSGA031784-TA和BGIOSGA013300-TA，且干湿交替诱导其中2个基因上调表达。值得注意的是，非编码区基因也参与了干湿交替诱导根表铁膜的形成过程，干湿交替明显诱导非编码区基因如NCRNA_4800的上调表达。非编码区可能在调控铁膜形成过程中也起着重要作用。

2.7响应干湿交替的氧化还原相关基因分析

从图6中可看出，氧化还原过程（oxidationreduction process）中的差异表达基因在GO生物过

程中所占的基因数目最多，其比例高达8.25%，说明了干湿交替明显诱导水稻根系氧化还原过程中相关基因的表达。其次为转录调控(regulation of transcription)、电子传递(electron transport)、蛋白磷酸化(protein phosphorylation)、蛋白质水解(proteolysis)、氧化胁迫响应(response to oxidative stress)、丝氨基酸代谢过程(serine family amino acid metabolic process)、蔗糖代谢过程（sucrose metabolic process）、淀粉代谢过程(starch metabolic process)和碳水化合物代谢过程(carbohydrate metabolic process)等的相关基因。其他(Others)尽管所占GO生物过程中的基因达66.42%，但是其中所包含的生物过程高达363条，且每条生物过程基因数目都低于1.40%。因此，根系氧化还原过程相关基因的变化响应了干湿交替诱导过程。

表4 38个差异表达基因的分类及注释Table 4. Categories and annotations of 38 differentially expressed genes.

图6 AWD vs CK数据库中的差异表达基因在生物过程（GO）中的分布情况Fig. 6. Distribution of differentially expressed genes in the biological process of GO classification in AWD vs CK library.

根据网络在线工具（http：//genedenovoweb. ticp.net：81/gdtools/index.php）中的表格筛选和合并功能将AWD vs CK数据库中共102个参与氧化还原过程中的差异表达基因筛选出来。结果发现，在干湿交替诱导过程中共有30个差异表达基因上调表达，72个差异表达基因下调表达（图7）。我们重点分析了30个上调表达差异基因并对其进行蛋白功能注释。结果发现，干湿交替处理诱导了多种氧化还原相关基因的上调表达，其中最多的为NAD(P)-依赖的氧化酶[NAD(P)-dependent dehydrogenase]、铁/抗坏血酸-依赖的氧化还原酶(iron/ ascorbate-dependent oxidoreductase family)、III型过氧化物酶(classical plant (class III) peroxidase subfamily)、缩氨酸-蛋氨基-S-氧还原酶[peptide-methionine (S)-S-oxide reductase activity]、乙醇酸氧化酶[peroxisomal (S)-2-hydroxy-acid oxidase]、脂肪酸去饱和酶（fatty acid_desaturase）等。我们通过对30个与氧化还原过程相关差异表达基因进行热图分析也得到同样的结果（图8）。

图7 氧化还原相关基因中上调或下调表达基因数目Fig. 7. Numbers of up-regulated or down-regulated genes associated with oxidation-reduction.

图8 30个差异表达基因热图分析Fig. 8. Heat map diagram of 30 differentially expressed genes.

图9 9个差异表达基因的验证分析Fig. 9. Verification assay of 9 differentially expressed genes.

2.8实时荧光定量PCR验证

为了验证差异表达基因数据的准确性，9个上调或下调表达基因被随机从4个数据库中选取进行实时荧光定量PCR分析。在9个差异表达基因中，有6个基因属于AWD vs CK数据库中与氧化还原相关且上调表达的基因。对于这9个基因，除了BGIOSGA026866-TA和BGIOSGA030543-TA基因外，其他基因的实时荧光定量PCR分析的表达模式与这些基因利用表达谱预测的结果相似（图9）。利用RNA-seq和qRT-PCR基因表达数值以2为底的对数进行线性回归分析。结果发现，两者的相关性非常高，相关系数达到0.90077（图10），验证了转录组数据的可信度。

图#10 qRT-PCR和转录组数据的线性回归分析#Fig. 10. Coefficient analysis of fold change data between qRT-PCR and RNA-seq.

图11 干湿交替对水稻根系活力和根表铁膜的影响Fig.11. Effect of alternate wetting and drying on root activity and iron plaque (IP) on rice root surface.

2.9干湿交替对水稻根系氧化力及根表铁膜形成的影响

从图11可知，干湿交替处理的水稻根系活力和根表铁膜数量明显增加（图11-C），与对照相比，干湿交替处理的水稻根系活力增加了22.9%。根表铁膜数量增加了45.7%（图11-B、D），表明干湿交替处理通过提高水稻根系活力产生了更多的根表铁膜。

3 讨论

转录组的应用在基因组序列、基因调控、基因差异、转录后修饰和基因拼接等方面对进一步理解植物的生理和分子机理提供了新的证据[25]。Neto等[26]研究发现，在氧化胁迫和非生物胁迫处理中，分别有990和1 727个差异表达基因被识别。其中，311个差异表达基因共同响应氧化胁迫和非生物胁迫。Tian等[27]对常规野生型水稻进行转录组分析发现，正常叶片与正常根系相比，有3 617个差异表达基因上调表达，4 171个差异表达基因下调表达，其中，有535个基因只在根系中表达，而不在叶片中表达。干旱胁迫的水稻根系与对照相比，有139个差异表达基因上调表达，有315个差异表达基因下调表达。最后发现了37个基因在水稻根系中特异表达。为野生型水稻在干旱胁迫条件下提供了一个转录组测序的资源。Wang等[28]研究发现，与光合作用相关的基因在叶片中普遍发现，与细胞膜合成和细胞壁修饰相关的基因在根系中大量发现。有5 284个差异表达基因响应了干旱胁迫，其中，有261个转录因子相关的差异表达基因受干旱胁迫的诱导。Ray等[29]研究发现，水分胁迫条件下有1 563个基因上调表达，1 746个基因下调表达。在干旱胁迫条件下6个植物品种中共发现了5 611个差异表达基因。因此，在转录组分析中，大量差异表达基因响应了非生物胁迫。本研究的结果也表明，在四个数据库中（AWD vs CK、AWD+Fe vs CK+Fe、CK+Fe vs CK和AWD+Fe vs AWD）共发现了3822个差异表达基因。其中，AWD vs CK（506上调和687下调）中差异表达基因数多于AWD+Fe vs CK+Fe（308上调和179下调），可能与水稻根表铁膜形成后恢复部分基因的表达水平有关。有趣的是，与干湿交替（AWD vs CK和AWD+Fe vs CK+Fe）相比，CK+Fe vs CK（728上调和1 175下调）和AWD+Fe vs AWD（1 252上调和1 189下调）有较多的差异表达基因，表明了水稻根表铁膜形成过程中也会诱导大量差异表达基因的响应。因此，干湿交替和铁膜形成过程都能诱导大量差异表达基因的响应，这进一步证实了我们之前的猜想。为了将问题简单化，本研究先通过干湿交替处理获得根系氧化力存在明显差异的水稻幼苗，然后再进行根表铁膜的诱导过程。

有研究表明，调控淀粉新陈代谢、抗氧化防御、呼吸和光合作用相关基因会响应干旱胁迫。同时，根系生长发育、细胞转运、逆境响应、木质素分解、新陈代谢、氧化还原反应和DNA复制等过程的相关基因也受干旱胁迫的诱导[30]。其次，光合作用、呼吸作用、能量的产生、碳-氮的吸收和活化、重要糖/淀粉途径和氨基酸代谢等相关基因响应干旱胁迫[31]。非生物胁迫也会调控植物激素。如植物激素脱落酸受非生物胁迫调控了许多植物的生长和发育[32]。干旱胁迫会诱导脱落酸相关基因的下调表达，与水分胁迫相关的关键酶参与了多元醇和糖类、氨基酸和季铵化合物、细胞壁松软和结构组分、胆固醇和长链脂肪酸、细胞分裂素和第二新陈代谢等的生物合成[29]。同时，干旱胁迫诱导细胞运输、信号转导、转录调控、细胞分裂和能量产生等相关基因的表达[33]。我们的研究结果也表明，利用GO分析对四个数据库中3 822个差异基因进行功能分类，发现新陈代谢过程、氧化还原过程、转录调控过程、电子传递、蛋白磷酸化过程、蛋白水解过程、氧化胁迫的响应过程和盐胁迫的响应过程都参与了干湿交替诱导水稻根表铁膜的形成过程。值得注意的是，根系氧化还原反应过程所占的基因比例较大。KEGG分析发现，在生物通路中，差异表达基因主要分布在代谢通路、生物合成通路、光合作用通路、信号刺激通路和细胞器通路。通过维恩图分析发现，在四个数据库中，有38个共同差异表达基因，这些基因与抗病性、抗旱性、细胞壁和细胞膜、氧化还原、蛋白激酶和转运、新陈代谢蛋白有关，进一步证实了氧化还原反应过程中差异表达基因响应了干湿交替过程。有趣的是，我们还发现4个潜在的基因未能识别其蛋白功能，其可能参与干湿交替诱导水稻根表铁膜的形成过程[34]。

从AWD vs CK数据库中对102个氧化还原相关的差异表达基因进行分析，发现有30个基因上调表达，72个基因下调表达（图2）。从这些上调表达基因中，有NADP依赖的氧化酶、铁/抗坏血酸依赖的氧化酶、Ⅲ型过氧化物酶、乙醇酸氧化酶、脂肪酸氧化酶和硫氧化还原酶等相关基因。干湿交替处理能够诱导大量根表铁膜的形成（图6），水稻根表铁膜的形成可能与这些基因编码的氧化酶产生大量的氧化性物质有关。有研究表明，光合作用（在光系统I和光系统Ⅱ中通过电子传递链产生）、呼吸作用（通过电子传递链产生）、乙醇酸氧化酶、草酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、脂肪酸氧化酶和过氧化物酶等都会产生大量的氧化性物质H2O2[35]。Wang等[36]研究发现，绑定在细胞质膜中的NADPH氧化酶催化产生H2O2[37]。其次，H2O2作为一种信号分子，能够改变和调节植物的生理生化过程[38,39]。有研究表明，光呼吸系统是产生H2O2最快速的一种方式，主要因为光呼吸系统中乙醇酸氧化酶催化乙醇酸，直接产生H2O2[40-42]。干湿交替被认为是一种适度的干旱胁迫，而适度干旱胁迫有利于H2O2的产生，H2O2主要来自于相应抗氧化酶如超氧化物岐化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等含量的上升，同时，又能降低H2O2的氧化胁迫[43,44]。我们的研究结果表明，干湿交替确实能够提高水稻根系氧化活力，诱导水稻根表铁膜的形成（图6）。因此，干湿交替处理可能诱导大量氧化还原酶相关基因的表达，促进水稻根表铁膜的形成。

此外，通过基因表达谱分析发现，干湿交替可能通过调控一系列基因的差异表达参与根表铁膜的形成，为根表铁膜形成机理的研究提供了理论依据。然而，除了水稻自身，根际特征等非生物因素对根表铁膜的形成也有一定影响[45]。干湿交替不仅影响了水稻根系的基因表达，同时也会改变根际周围土壤的氧化还原状态。有研究发现，干湿交替过程中，土壤氧化还原电位升高，土壤通气性增强，根际的氧环境改变等，增加了根表铁膜形成所必需的氧气[3]，这不仅可以直接影响根表铁膜的形成，也可以通过提高水稻根系氧化力进而影响根表铁膜形成。水分状况的改变也会导致土壤中的铁形态发生变化，在干湿交替过程中，土壤中的结晶态氧化铁和无定形氧化铁相互转化，Fe2+与Fe3+相互转化，铁形态的变化影响根表铁膜的形成[46]。另一方面，干湿交替也会影响根际微生物的活性和群落结构。与铁膜形成相关的铁氧化细菌和铁还原细菌可能通过响应干湿交替过程改变其数量和活性，进而影响铁膜的形成[47]。可见根表铁膜的形成是一个复杂的过程，根际土壤环境对根表铁膜形成的影响有待进一步研究。

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Gene Expression Profile Analysis for Alternate Wetting and Drying Induced Formation of Iron Plaque on Root Surface of Rice Seedlings

FU Youqiang1,2, YU Xiaoli1, YANG Xujian1, SHEN Hong1,*
(1College of Natural Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;2Rice Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China;*Corresponding author, E-mail： hshen@scau.edu.cn)

【Objective】Alternate wetting and drying (AWD) could enhance root activity and resistance to environmental stresses, which is the most important management in rice cultivation. AWD could induce the formation of iron plaque on root surface of rice seedlings significantly. However, differentially expressed genes (DEG) of rice roots remains unknown in the process of AWD induced formation of iron plaque. 【Method】In this study, DEG of rice roots were investigated in response to waterlogging (CK), AWD, CK+Fe, AWD+Fe treatments in sand-culture experiments.【Results】Compared with CK, AWD induced up-regulated expression of 506 DEG and down-regulated expression of 687 DEG. Compared with CK+Fe, AWD+Fe induced up-regulated expression of 308 DEG and down-regulated expression of 179 DEG. Compared with CK, CK+Fe induced up-regulated expression of 728 DEG and down-regulated expression of 1175 DEG. Compared with AWD, AWD+Fe induced up-regulated expression of 1252 DEG and down-regulated expression of 1189 DEG. Results from Venn diagram analysis indicated that 3822 DEG were involved in the process of AWD-induced formation of iron plaque on root surface. Gene Ontology(GO) analysis showed that a total of 270 DEG participated in the oxidation-reduction process, and 165 DEG were related to the functions of redox enzymes. Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) results indicated that DEG involved in organelle class, signal stimulus, photosynthesis, metabolism and synthesis etc. participated the regulatory process of AWD induced formation of iron plaque on root surface. Thirty eight shared genes showed differential expression in process of both AWD and the formation of iron plaque. The proteins encoded by these genes were responsible for the resistance to disease, drought, redox, translocation and metabolism of rice. In comparison to CK, AWD induced 102 DEG in the process of oxidation and reduction, which accounted for 8.25% of the total. AWD enhanced up-regulated expression of genes that were associated with peroxidase, fatty acid oxidase, glycolic oxidase etc. In comparison to CK, AWD raised root activity and amount of iron plaque on root surface by 22.9% and 45.7%, respectively. Results of real-time RT-PCR confirmed the transcriptional group analysis with the correlation coefficient 0.90. 【Conclusion】 AWD induced expression of many differential genes, enhanced root oxidative capacity, and formed iron plaque on root surface. Peroxidase, fatty acid oxidase and glycolic oxidase might be important genes involved in AWD-induced formation of iron plaque on root surface of rice seedlings.

rice seedling; alternate wetting and drying (AWD); iron plaque; differentially expressed gene (DEG); oxidation-reduction related genes.

S143.7+2; S511.061

:A

:1001-7216(2017)02-0133-16

2016-07-31；修改稿收到日期:2016-11-22。

国家自然科学基金资助项目（31372125）；广州市科技计划资助项目（2014J4100240）。