特发性膜性肾病患者血清中小麦蛋白抗体的水平变化及意义

朱超亚，刘志刚，黄俊，魏清柱，刘爱群，吴碧芳，洪国保，祝爽爽，邹和群

(1南方医科大学附属第三医院·泌尿疾病研究所，广州 510630；2深圳大学医学院; 3广州市第一人民医院)

特发性膜性肾病患者血清中小麦蛋白抗体的水平变化及意义

朱超亚1，刘志刚2，黄俊3，魏清柱1，刘爱群1，吴碧芳1，洪国保1，祝爽爽1，邹和群1

(1南方医科大学附属第三医院·泌尿疾病研究所，广州 510630；2深圳大学医学院; 3广州市第一人民医院)

目的 探讨特发性膜性肾病(IMN)患者血清中小麦蛋白抗体的水平变化及意义。方法 运用液氮研磨丙酮提取法粗提取小麦总蛋白，以此蛋白作为抗原，采用ELISA双抗体间接法检测40例IMN患者(IMN组)、34例其他肾小球肾炎患者(其他肾炎组)和40例健康人(对照组)血清中小麦蛋白特异性抗体IgG、IgA和IgE水平，并对患者进行食物过敏情况问卷调查，观察小麦蛋白特异抗体水平明显变化患者的临床特征。结果 IMN组血清中小麦蛋白特异性IgG水平低于对照组(P<0.01)、其他肾炎组(P<0.05)；其他肾炎组与对照组比较，P﹥0.05；各组血清中小麦蛋白特异性IgA水平比较，P>0.05；各组血清中均未检测到小麦蛋白特异性IgE。与其他肾炎组比较，IMN组血清肌酐、24 h尿蛋白定量升高，血浆白蛋白降低(P均<0.05)；两组eGFR比较，P﹥0.05。20例血清中小麦蛋白特异性IgG抗体水平明显降低(低于中位数)的IMN患者中12例尿蛋白大于5 g/24 h，且血清白蛋白水平<20.0 g/L。结论 IMN 患者血清中小麦蛋白特异性IgG升高，IgA、IgE无变化，IgG可能与IMN发生、发展有关。

特发性膜性肾病；小麦蛋白抗体；酶联免疫吸附试验

膜性肾病是一种以肾小球毛细血管袢上皮侧下大量免疫复合物沉积，并伴有肾小球基底膜弥漫增厚及足细胞足突广泛融合为特征的病理诊断[1]。根据其病因分为特发性、继发性及家族性三大类，而原因未明的特发性膜性肾病(IMN)约占2/3[2],其是导致成人出现肾病综合征最常见原因[3，4]。随着病情缓慢进展，IMN患者中有30%～50%可在20年内进展为终末期肾脏病。然而，IMN的确切病因及致病机制仍不明确。2011年Debiec等[5]研究发现，阳离子牛血清白蛋白(BSA)可能是儿童，特别是小于5岁的IMN患儿的主要致病靶抗原之一，而牛奶是获得这一致病抗原的主要途径，这提示食物抗原可能导致或参与IMN的发病。目前在国内尚未见食物抗原与IMN发病关系的报道,我们率先研究了国内IMN患者与食物小麦的关系，检测和比较了IMN患者、其他肾脏疾病患者及健康人血清中小麦粗提蛋白特异性抗体IgG、IgA和IgE水平，旨在初步探讨小麦在IMN发病中可能存在的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年6月～2015年11月于南方医科大学第三附属医院经肾活检病理诊断为IMN的患者40例(IMN组)，男21例、女19例，年龄(47.65±13.46)岁；经肾活检病理诊断为其他肾小球肾炎患者34例(其他肾炎组)，包括IgA肾病患者15例、系膜增生性肾小球肾炎患者7例、局灶性节段性肾小球硬化患者3例、微小病变肾病患者3例、狼疮膜性肾病患者3例，血管炎性肾病患者、乙肝相关性系膜增生性肾小球肾炎患者、糖尿病肾病患者各1例，该组中男15例、女19例，年龄(35.85±12.09)岁。选取40例健康体检结果无异常发现的健康体检者(对照组)，其中男22例、女18例，年龄(38.65±10.61)岁。IMN患者除外过敏性紫癜、乙肝病毒相关性肾炎、系统性红斑狼疮、肿瘤等继发性病因者。对照组均无肾病及其他疾病个人史和家族史，尿常规、肾功能及其他健康体检实验室检查结果均正常。IMN组年龄高于其他肾炎组及对照组，性别差异无统计学意义。

1.2 临床资料收集 收集血肌酐、血清白蛋白、24 h尿蛋白，采用肾脏病膳食改良试验简化公式计算GFR估算值(eGFR)，MDRD简化公式：eGFR=[175× (Scr)-1.234×(年龄)-0.179×(男性,×0.79)]。并对所有入组者进行食物过敏情况问卷调查。

1.3 小麦蛋白粗提取 将小麦放入液氮中研磨成粉末后，转移烧杯中加4 ℃预冷的丙酮浸泡(按1体积粉末加4体积丙酮比例)，放入冰水中冰浴，放4 ℃冰箱。期间每隔2小时更换新的丙酮，直至丙酮澄清，放置4 ℃冰箱1 d。倒去上层丙酮，将沉淀在烧杯底部的蛋白倒在保鲜膜上或者锡纸上铺开，放在通风厨吹干。吹干后，将粉末收集到烧杯中，加入PBS磁铁搅拌子搅拌溶解，4 ℃冰箱中，搅拌过夜，或用分散仪破碎。溶解完后冷冻离心机上10 000 r/min离心15 min，取上清继续离心，共3次。上清液在冰上用0.45 μm分子筛注射过滤，收集过滤液，即为蛋白粗提液。用BCA试剂盒测蛋白浓度，按照试剂盒标准步骤进行。剩余蛋白粗提液冻存于-80 ℃冰箱待用。根据测得浓度上样50 μg，进行SDS-PAGE电泳(按标准步骤进行)。

1.4 各组血清中小麦蛋白特异性抗体IgG、IgA、IgE的检测 IMN组和其他肾炎组留取肾活检当日清晨空腹静脉血，对照组留取清晨空腹静脉血，标本均采5 mL，置于促凝剂试管中，立即用离心机离心15 min，转速为4 000 r/min,分离留取上层血清,冻存于-80 ℃冰箱待检。采用ELISA双抗体间接法检测：将小麦粗提蛋白用CBS稀释至1 μg/mL，向96孔板中每孔加入稀释后的小麦蛋白液100 μL，置4 ℃冰箱过夜后取出；每孔中加入用PBS稀释成5%浓度的BSA液200 μL，置37 ℃恒温箱中2 h后取出，每孔加入PBST 300 μL，置于自动洗板仪上振荡清洗，2 min/次，共2次；拍干96孔板，向孔中加入用PBST稀释的血清(血清∶PBST体积比为1∶30)，100 μL/孔，置37 ℃恒温箱中1 h后取出，每孔加入PBST 300 μL置于自动洗板仪上振荡清洗，2 min/次，共5次；拍干96孔板，向孔中加入用PBST稀释的IgG(IgG∶PBST体积比为1∶8 000)或IgA(IgA∶PBST体积比为1∶6 000)或IgE(IgE∶PBST体积比为1∶400)，100 μL/孔，置37 ℃恒温箱中1 h后取出，每孔加入PBST 300 μL置于自动洗板仪上振荡清洗，2 min/次，共6次。拍干96孔板，每孔中加入现配A+B混合液(A∶B体积比为1∶1) 100 μL，置室温中待96孔板显色后，立即向孔中加入终止液2 mol/L H2SO450 μL，并立即置于酶标仪中检测。TWB吸收波长450 nm处读值。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。连续性计量资料用中位数与四分位数间距表示，两组间比较用Mann-WhitneyU非参数检验，多组间比较采用Kruskal-WalisH非参数检验，组间多重比较用Dunn′st检验。计数资料用频次或百分比表示，比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 粗提取的小麦蛋白 提取到小麦蛋白，经BCA试剂盒测得浓度为5.063 mg/mL，并经SDS-PAGE电泳验证。

2.2 食物过敏情况调查结果 参与本研究的所有IMN患者否认进食某些食物后出现嘴唇或面部肿胀、全身风团、瘙痒、荨麻疹、腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发热、气管收缩或抽搐等。所有IMN患者无明确的食物过敏史。

2.3 IMN组与其他肾炎组临床指标比较 IMN组血清肌酐、血浆白蛋白、24 h尿蛋白定量、eGFR分别为109.5(84.50～173.75)μmol/L、21.29(19.40～23.65)g/L、4.36(3.84～5.48)g、67.69(36.85～92.57)mL/(min·1.73 m2)，其他肾炎组分别为83(61.00～118.00)μmol/L、37.00(31.30～42.20)g/L、0.46(0.31～2.89)g、90.31(67.08～133.05)mL/(min·1.73 m2)。IMN组与其他肾炎组血清肌酐、血浆白蛋白、24 h尿蛋白定量比较，P均<0.05；两组eGFR比较，P﹥0.05。另外，我们观察了血清中小麦蛋白特异性IgG抗体水平明显降低(低于中位数)的20例IMN患者的临床资料，发现其中12例尿蛋白大于5 g/24 h，且血清白蛋白水平<20.0 g/L。

2.4 各组血清中小麦蛋白特异性抗体IgG、IgA、IgE水平比较 各组血清中小麦蛋白特异性IgG水平对应OD值中位数由高到低分别为：对照组1.020 0、其他肾炎组0.741 4、IMN组0.543 9；IMN组低于对照组(P<0.01)、其他肾炎组(P<0.05)；其他肾炎组与对照组比较，P﹥0.05。各组血清中小麦蛋白特异性抗体IgA水平对应OD值中位数由高到低分别为：IMN组0.500 3、其他肾炎组0.429 8、对照组0.376 5；三组比较，P>0.05。各组血清中均未检测到小麦蛋白特异性IgE。

3 讨论

本研究是国内首次研究食物小麦与IMN关系的研究。我们通过检测和比较多组肾脏病患者血清以及健康人血清中小麦蛋白特异性抗体IgG、IgA、IgE水平，结果发现IMN患者血清中小麦蛋白特异性抗体IgG水平低于其他肾炎组及对照组；而血清中小麦蛋白特异性抗体IgA水平在各组间比较无统计学意义；在各组血清中均未检测到小麦蛋白特异性抗体IgE。提示小麦特别是小麦蛋白特异性抗体IgG可能参与IMN的发病过程或者疾病进程。

早在20世纪80年代末，就有关于饮食与IMN关系的研究。Kawaguchi等[6]在被动IMN模型大鼠中发现，高蛋白饮食会引起严重的蛋白尿和肾小球硬化肾小管损伤，在给予低蛋白饮食一段时间后，大鼠的蛋白尿完全消失，提示日常饮食对IMN临床发展具有一定影响。另有学者在研究黏膜免疫与原发肾小球肾炎的关系中发现，在IMN患者血清中有高水平抗BSA、卵白蛋白、鸡溶解酵素、α乳白蛋白等抗食物蛋白的IgA抗体，进一步提示食物与IMN有一定关系。

2014年周朝敏等[7]在研究IgA肾病患者6种食物(花生、牛奶、鸡蛋、大豆、虾、鱼)主要抗原特异性抗体水平中发现了食物抗原特异性IgG水平的升高，与本研究中各组肾病患者小麦蛋白特异性IgG水平低于健康人水平的结果相反，这可能与其检测的是食物中特异抗原对应的特异性抗体，而我们检测的是小麦粗提总抗原蛋白特异性抗体有关；同时也可能与我们选入的各类肾病患者在纳入研究时病情较重、病程较长有关；另外，也可能是血清中小麦蛋白特异性抗体IgG经过血液循环沉积于肾小球上，降低了血清中IgG水平。本研究结果显示，三组小麦蛋白特异性抗体IgA水平虽然在数据上有差异，但无统计学意义，与Rostoker等[8]研究结果相似，可能与本研究中使用的小麦抗原蛋白是粗提总蛋白有关。

本研究中根据1999 年国际食品法典委员会第23次会议公布的常见致敏食物清单，选择了小麦这种常见致敏食物作为研究对象。小麦蛋白具有较强致敏性或抗原性。抗体IgE介导速发型过敏反应，过敏患者体内会出现高水平特异性IgE，一般过敏症状突出与接触过敏物质有关，正常情况下抗体IgE在人体血清中含量极低。本研究中的所有对象经过问卷调查，均承认日常饮食中有接触小麦面粉类食物，但均否认小麦类食物过敏史及在接触该食物后出现可疑过敏症状，比如唇部或面部肿胀、皮肤瘙痒、腹泻、呕吐、发热、气管收缩或抽搐。本研究中入选者血清中均检测不到抗小麦蛋白特异性IgE，与调查相一致。

Jacobs等[9]在研究中发现花生经过消化吸收后仍有完整的花生过敏原被血小板运输到体内，引起过敏反应，提示食物通过消化吸收后可以导致疾病发生。小麦含有丰富的凝集素，凝集素不会被烹饪或者消化作用破坏。凝集素作为碳水化合物结合蛋白，能选择性及特异性地与细胞表面的糖蛋白或糖脂上的碳水化合物基团结合，而PLA2R是表达于正常肾小球足细胞上的糖蛋白重要组成部分。小麦很可能以凝集素的方式识别并结合了肾小球上PLA2R，导致IgG-小麦抗原蛋白复合物在肾小球的沉积。另外，有研究表明肾小球疾病患者的肠道通透性明显增加，而肠道通透性增加可促进肠道多种抗原进入血液循环，因而也更容易使含多种食物抗原的循环免疫复合物沉积到肾小球。肠道免疫主要为IgA介导的黏膜免疫，而我们研究中各肾病患者血清中小麦蛋白特异抗体IgA水平均较健康人升高，虽然各组间比较差异无统计学意义，仍表明IMN患者黏膜免疫活跃、肠道通透性增加。同时，我们观察了血清中小麦蛋白特异性抗体IgG水平明显降低，且IMN患者中大部分尿蛋白增多、血清白蛋白低。提示小麦可能在IMN的疾病进程中有重要作用。

总之，本研究从血清学水平研究食物小麦与IMN的关系，提示小麦在IMN致病或进程中可能起一定作用，并初步探讨小麦参与IMN发病机制和发病进程的可能性。为进一步研究IMN的发病机制指出了一个新的方向，也为以后探索食物与IMN发病关系的研究奠定了一定实验基础。

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邹和群(E-mail: hequnzou@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.29.028

R692

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1002-266X(2017)29-0084-03

2017-04-26)