染色体微阵列分析技术在不明原因智力低下患儿中的应用

陆芬，张跃，杜森杰，李红英，张丽

(南京医科大学附属儿童医院，南京210008)

染色体微阵列分析技术在不明原因智力低下患儿中的应用

陆芬，张跃，杜森杰，李红英，张丽

(南京医科大学附属儿童医院，南京210008)

目的 探讨染色体微阵列分析(CMA)技术在不同原因智力低下患儿中的应用效果。方法 应用苏州铂金埃尔默公司提供的染色体微阵列芯片CGX-SNP对83例无明显高危因素智力低下儿童进行基因组学研究。CMA分析所发现的染色体微缺失/微重复(CNVs)，进一步通过荧光原位杂交或实时荧光定量PCR反应进行验证。结果 38例(45.8%，38/83)患儿检测到染色体异常。单亲二倍体1例(1/38,2.6%)，三体2例(2/38,5.3%)，短臂单体1例(1/38,2.6%)，大片段重复3例(3/38,7.9%)，大片段缺失2例(2/38,5.3%)，CNVs 29例(29/38,76.3%),检测到携带临床致病性CNVs患儿 25例，检出率达30.1%。结论 CMA检查可及时发现智力低下患儿染色体异常，将检出率提高至10%以上。

智力低下；染色体微阵列分析；染色体微缺失；染色体微重复；基因组学;儿童

智力低下(MR)是指智力损伤发生在发育时期、主要表现为智力明显低于一般人水平，并伴有明显的适应行为障碍[1]。2000年抽样调查报告证实，我国0～6岁儿童智力残疾现患率为0.931%，相当于我国有智力残疾儿童1 300万人，年均发现率为0.133%[2]，其中2/3原因不明。有调查发现，引起MR的先天、遗传因素占11.21%[3]，居第4位，该因素引起的儿童MR程度以重型为主，提示在胎儿大脑发育初期，智力损害程度明显高于后天致残。同时该因素导致的MR治疗效果差，因此需要合理的检测手段确定MR的病因。由于传统的细胞遗传学分析方法如G显带染色体分析法，分辨率不高，仅能检测较大的染色体畸变(>5 Mb)，因此，许多被诊断为“正常”结果的病例往往隐藏着染色体亚显微结构的异常。染色体微阵列(CMA)技术是最近发展起来的主要用于检测染色体亚显微缺失/微重复(CNVs)的一项技术，能将临床致病性CNVs检出率提高到10%以上[4]。本研究探讨了其应用于MR患儿中的价值。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年6月～2017年3月在南京医科大学附属儿童医院就诊的不明原因MR患儿83例，均符合Gesell发育诊断量表(Gesell Development Scale，北京修订版，1986年)中的诊断标准。年龄3个月～4岁，其中男42例、女41例，适应行为能区发育商为24～73分、多数为40～54分。无相关家族史，83例患儿认知落后，所有家系均签署知情同意书，同意参加全基因组CMA的检测。本研究获得南京儿童医院伦理委员会批准。纳入标准：不明病因的MR患儿指排除出生时、出生后相关高危因素，同时具有以下至少1个条件：伴其他系统畸形；具有典型面部特征或异常面容；母亲具有异常妊娠史。排除标准：已明确的遗传代谢性疾病(如苯丙酮尿症、甲状腺功能减退症等)导致的MR。

1.2 诊断方法 采用Gesell发育诊断量表-中文修订版进行诊断。Gesell发育量表包括评定儿童的大运动、精细动作、语言、社交、适应行为5个能区，计算每个能区的发育商(DQ)。DQ=DA/CA×100[DA：发育年龄(周)；CA：实际年龄(周)]；根据适应行为能区发育商高低判断MR程度：轻度:55≤DQ≤75；中度:40≤DQ≤54；重度:25≤DQ≤39；极重度:DQ<25。

1.3 检测方法 采集病史，同时采取患儿静脉血2 mL，应用铂金埃尔默DNA提取试剂盒提取基因组DNA，所用的芯片为苏州铂金埃默公司提供的CGX-SNP芯片。CMA分析所发现的CNVs都进一步通过荧光原位杂交或实时荧光定量PCR反应进行验证。对所得的原始数据应用苏州铂金埃尔默数据库进行分析。参照国际基因组CNV多态性数据库DGV、UCSC Genome Browser、DECIPHER以及ISCA数据库及相关文献判读CNV。严格按照美国医学遗传学会的指南[5]，将CNVs分为4个等级：临床致病性CNVs，临床可能致病性CNVs，临床意义不确定性CNVs，良性CNVs。

2 结果

本研究中，MR患儿83例，染色体异常38例(38/83，45.8%)。单亲二倍体1例(1/38,2.6%)，三体2例(2/38,5.3%)，臂单体1例(1/38,2.6%)，大片段重复3例(3/38,7.9%)，大片段缺失2例(2/38,5.3%)，CNVs 29例(29/38,76.3%)。

根据CMA结果解读，29例CNVs患儿中，携带临床致病性CNVs 25例(25/29,89.3%)，携带临床意义不能确定性CNVs 4例(4/29,13.7%)。25例携带临床致病性CNVs的患儿中染色体微缺失17例(17/25,68.0%)，微重复4例(4/25,16.0%),微重复+微缺失4例(4/25,16.0%)。患儿CNVs分布于多个不同的染色体区域，分别为X染色体4例(4/25,16.0%)、1号染色体3例(3/25,12.0%)、2号染色体2例(2/25,8.0%)、7号染色体2例(2/25,8.0%)、15号染色体2例(2/25,8.0%)、17号染色体2例(2/25,8.0%)，其余14例(10/25,40.0%)为散发CNVs。

25例携带临床致病性CNVs的患儿中Angelman综合征/Prader-Willi 综合征2例(15q11.2q13.1区域微缺失)、Wolf-Hirschhorn综合征1例(4p16.3区域微缺失)、Miller-Dieker综合征1例(17p13.3区域微缺失)、Williams综合征1例(7q11.23区域微缺失)、Waardenburg综合征1例(2q35-q36.1区域微缺失)、1p36缺失综合征1例(1p36.31-p36.33微缺失)、MECP2重复综合征1例(Xq28区域441.88 kB的重复)，其余17例未明确提示某种CNVs。

本研究共83例患儿，25例患儿检测到携带临床致病性CNVs，检出率达30.1%。我们进一步对携带临床致病性CNVs中患儿其中3例的父母样本进行了CMA检测，结果显示2例患儿的CNVs遗传自健康父母中的一方，1例患儿的CNVs为新发变异。

3 讨论

MR作为一组表型、基因型高度异质性的疾病，遗传病因复杂。传统的细胞遗传学分析方法如G显带染色体分析法，其分辨率不高，仅能检测较大的染色体畸变，CMA是最近发展起来的主要用于检测染色体CNVs的一项技术，能将CNVs检出率提高到10%以上。目前CMA主要有两大平台。一种是比较基因组杂交芯片(aCGH)，其基本原理是将待测样本DNA与正常对照样本DNA分别用不同的荧光标记，通过与芯片上固定探针进行竞争性杂交获得定量的拷贝数检测结果；另外一种是单核苷酸多态性微阵列芯片(SNP array)，其基本原理是将探针连接在微珠上，然后将携带探针的微珠随机黏附在芯片上，待测样本DNA和探针进行杂交及单碱基延伸，通过对荧光信号扫描，分析待测样本CNV及基因型，该平台在分析患者的基因组时不需要正常对照样本[6]。通过aCGH技术能够准确地检出CNV，而SNP array除了能够检出CNV外，还能够检测出大多数的单亲二倍体和一定比例的嵌合体[7]。同时涵盖CNV和SNP的芯片具备双重优势，在检测的敏感性、特异性、可靠性等方面得到很大提高。

美国妇产科学会2013年版指南[8]提出，“如产前发现超声异常，CMA检测方法最为有益”，CMA可替代传统核型分析。2016年7月《中华儿科杂志》发布了《染色体基因组芯片在儿科遗传病的临床应用专家共识》[9]，为CMA在我国的应用提供了指南。目前国内外CMA在产前诊断中应用较广泛，Shaffer等[10～12]通过大量产前诊断样本(主要来自羊水、流产样本等)检测提示有临床意义的CNVs检出率上升为6.0%～6.5%。常亮等[13]通过采用SNP array及染色体核型分析对2012年7月～2013年12月在北京大学第三医院妇产科就诊的141例产前诊断为高危孕妇进行的对比分析，发现染色体核型分析异常率为6.4%，SNP array异常率为11.3%，两种检测技术检测出的异常核型率比较差异有统计学意义。吴晓丽等[14]采用CMA技术对88例染色体核型分析正常的先天性心脏病胎儿进行了检测，发现14例(16%)胎儿CNV结果为临床致病性CNV。这些研究均表明CMA在产前诊断中应用广泛，且阳性率高。CMA可以作为产前诊断标准检测的一部分应用于临床。国内刘欣等[15]的研究发现，CMA对各种类型神经发育性疾病患儿的分子诊断率并不一致。其中，CMA对MR患儿的分子诊断率最高，达26.3%。

本研究对83例MR患儿进行了CMA的检测，共检测出25例患儿携带临床致病的CNVs，检出率为30.1%。明显高于研究[6]报道的15%～20%的检出率。分析可能原因为本研究病例数相对较少，增加了染色体基因CNVs异常检出率，需进一步加强病例收集。25例携带临床致病的染色体微失衡患儿，其中16例伴有面容特殊或者其他系统畸形，所以临床上MR同时伴有面容特殊及其他系统畸形患儿应首先选择CMA。

目前临床上常见的CNVs综合征至少有67种,如Angelman 综合征、Prader-Willi 综合征、Wolf-Hirschhorn 综合征、DiGeorge 综合征、Miller-Dieker 综合征、Williams综合征等。国内外多个研究结果显示，临床致病性CNVs患儿中，Prader-Willi综合征/Angelman综合征(PWS/AS)的所占比例最高[16]。但本研究提示，X染色体临床致病的CNVs最高，1号染色体临床致病CNVs次高，PWS/AS的所占比例位于第3位，考虑可能与本研究病例数少有关。本研究未发现DiGeorge综合征患儿。

国外多个研究表明，Williams综合征、Miller-Dieker综合征、Wolf- Hirschhorn 综合征、1p36缺失综合征、Waardenburg综合征Ⅰ型均具有特殊面容，且各自具有特征性临床表现，但目前国内相关研究较少，对一些面容特殊合并MR儿童建议尽早完善CMA助诊,对于诊断、判断预后及优生优育指导有重要意义。

本研究结果也表明，CNVs在中国儿童MR患儿中发病率高，这一结果肯定了CMA技术的优势，但目前仍存在一些挑战，如对照数据库的缺乏和临床意义未知的CNVs没法解释等。本研究29例CMA阳性患儿中就有4例(13.8%)临床意义不明。但从研究的角度，随着病例的积累及数据库的不断完善，这些临床意义不明确变异最终可能成为与疾病相关的新的致病区域，为以后的分析提供拷贝数多态性参考。

对面容异常、MR、生长发育缓慢等患儿进行CMA检查，可及时发现染色体异常。从优生考虑,CMA检测对患儿家庭有明显指导意义,比如本研究内有4例患儿存在2处CNVs，根据结果建议患儿父母进一步完善核型分析，以判断患儿CNV是否来自父母，或源于父母的染色体平衡易位，评估再发风险。又如MECP2重复综合征，该患儿家族谱系中存在该变异，有必要对家族中其他成员进行遗传学检测，为家族中可能的携带者进行遗传咨询和必要的遗传学检测,评估子代的发生风险。但是目前染色体芯片不能检测染色体平衡易位(相互易位、罗宾逊易位、倒位、平衡性插入等)，且染色体嵌合性检测精确性尚未确立，同时会检出临床意义不明的CNVs。对于高度怀疑染色体易位患儿建议完善染色体核型分析。CMA技术不能检测单基因病，怀疑单基因病患儿应首选单基因检测。

[1] 卓大宏.中国残疾预防学[M].北京:华夏出版社,1998:3-5.

[2] 王新宪,朱庆生.中国0～6岁残疾儿童抽样调查报告[M].北京：中国统计出版社,2001:66-77,94-103.

[3] 邱文英.116例智力低下儿童病因分析及防治对策[J].现代预防医学,2008,35(14):2665-2666.

[4] De Vries BB, Pfundt R, Leisink M, et al. Diagnostic genome profiling in mental retardation[J]. Am J Hum Genet, 2005,77(4):606-616.

[5] Miller DT, Adam MP, Aradhya S, et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies[J]. Am J Hum Genet, 2010,86(5):749-764.

[6] Manning M, Hudgins L. Array-based technology and recommendations for utilization in medical genetics practice for detection of chromosomal abnormalities[J]. Genet Med, 2010,12(11):742-745.

[7] Lay-Son G, Espinoza K, Vial C, et al. Chromosomal microarrays testing in children with developmental disabilities and congenital anomalies[J]. J Pediatr (Rio J), 2015,91(2):189-95.

[8] American College of Obstetricians and Gynecologists Committee on Genetics. Committee Opinion No. 581: the use of chromosomal microarray analysis in prenatal diagnosis[J]. Obstet Gynecol, 2013,122(6):1374-1377.

[9] 中国医师协会医学遗传学分会,中国医师协会青春期医学专业委员会临床遗传学组,中华医学会儿科学分会内分泌遗传代谢学组.染色体基因组芯片在儿科遗传病的临床应用专家共识[J].中华儿科杂志,2016,54(6):410-413.

[10] Shaffer LG, Dabell MP, Fisher AJ, et al. Experience with microarray-based comparative genomic hybridization for prenatal diagnosis in over 5 000 pregnancies[J]. Prenat Diagn, 2012,32(10):976-985.

[11] Wapner RJ, Martin CL, Levy B, et al. Chromosomal microarray versus karyotyping for prenatal diagnosis[J]. N Engl J Med, 2012,367(23):2175-2184.

[12] Breman A, Pursley AN, Hixson P, et al. Prenatal chromosomal microarray analysis in a diagnostic laboratory; experience with >1 000 cases and review of the literature[J]. Prenat Diagn, 2012,32(4):351-361.

[13] 常亮,赵楠,魏媛,等.单核苷酸多态性微阵列与染色体核型分析的产前诊断意义比较[J].北京大学学报(医学版),2014,46(5):676-680.

[14] 吴晓丽,符芳,李茹,等.染色体微阵列分析技术对先天性心脏病胎儿进行遗传病因学诊断的临床价值[J].中华妇产科杂志,2014,49(12):893-898.

[15] 刘欣,刘宏景,王丽,等.染色体芯片分析对神经发育性疾病的分子诊断率研究[J].中华检验医学杂志,2016,39(4):246-250.

[16] Li Y, Qiu W, Ye J, et al. Analysis of copy number variations in 66 children with unexplained mental retardation/developmental delay using chromosomal microarrays[J]. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi, 2014,31(6):703-717.

张跃(E-mail：feiyuezhang@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.29.027

R179

B

1002-266X(2017)29-0081-03

2017-03-28)