EV71感染手足口病患儿血清IL-6、IL-13水平变化及其原因

何春卉

(广州市妇女儿童医疗中心，广州 510000)

EV71感染手足口病患儿血清IL-6、IL-13水平变化及其原因

何春卉

(广州市妇女儿童医疗中心，广州 510000)

目的 探讨肠道病毒71型(EV71)感染引起的手足口病(HFMD)患儿血清IL-6和IL-13水平变化及其原因。方法 以EV71感染的HFMD患儿作为观察组，健康体检者作为对照组，用ELISA法测定两组血清IL-6和IL-13水平。比较观察组中严重程度不同(临床Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期)的HFMD患儿血清IL-6和IL-13水平。采用利巴韦林等抗病毒治疗。对比治疗前后血清IL-6和IL-13水平变化。用流式细胞仪测定单核细胞中IL-6和T细胞中IL-13的表达水平。EV71感染从健康人全血中分离出来的单核细胞和T细胞，制成感染阳性细胞，检测其细胞中IL-6和IL-13的表达水平，以未感染的单核细胞及T细胞作为阴性对照细胞。结果 观察组治疗前血清中IL-6和IL-13水平与对照组相比升高(P均<0.01)。 与治疗前比较，治疗后观察组不同分期患者血清IL-6和IL-13水平均下降(P均<0.01)。不同分期间，随着临床分期升高，血清IL-6、IL-13水平升高(P均<0.01)。与对照组比较，观察组各分期单核细胞中IL-6和T细胞中IL-13表达水平均高(P均<0.05)。EV71感染单核细胞和T细胞后，其IL-6和IL-13表达水平高于阴性对照细胞(P均<0.05)。结论 EV71感染HFMD患儿血清IL-6和IL-13水平升高，其原因可能是FV71感染的单核细胞表达IL-6和T细胞表达IL-13能力增强。

手足口病；白细胞介素6；白细胞介素13；肠道病毒71型；儿童

1957年，新西兰首次报道了手足口病(HFMD)[1]，由于免疫力的差异，HFMD多在5岁以下儿童群体传染，出现口痛、低热、胃纳差、手足口部位疱疹或溃疡的临床症状，在免疫力较强的成人群体中，除了重症感染患者，其他多处于隐性潜伏状态，易成为传染源[2]。现已发现柯萨奇病毒A16(CVA16)和肠道病毒71型(EV71)均能引起HFMD，且从初期的临床症状上难以区分[3]。但CVA16引起的HFMD一般较少出现并发症[4]，EV71引起的HFMD患者常出现严重的神经系统并发症[5，6]。据研究，EV71属小RNA病毒科，肠道病毒属，是一种正义单链RNA病毒[7，8]。研究表明，参与炎症发生过程的细胞因子在EV71感染导致的HFMD病程中可能起了关键作用。但关于EV71导致HFMD发生的病理过程中IL-6和IL-13所起的作用研究报道较少。本研究对36例确诊为EV71感染导致的HFMD住院患儿血清IL-6和IL-13水平变化进行了观察，并探讨了血清IL-6和IL-13水平变化的原因。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2015年1～12月广州市妇女儿童医疗中心共收治和确诊EV71感染的HFMD住院患儿36例(观察组)，符合“手足口病治疗指南(2010年版)”[9]。男20例、女16例，年龄(25.19±8.92)个月。对照组为本院同期健康体检者20例，男11例、女9例，年龄(25.56±10.31)个月。患者根据“陕西省EV71感染重症手足口病病例临床诊断与治疗专家共识(2014年修订版)”的临床特征分期[10]如下：神经系统受累期(临床Ⅱ期)患儿12例，年龄(26.32±9.81)个月；心肺衰竭前期(临床Ⅲ期)患儿12例，年龄(23.63±10.21)个月；心肺衰竭期(临床Ⅳ期)患儿12例，年龄(25.63±11.23)个月。两组性别比例、年龄分布均衡。

1.2 治疗方法 应用利巴韦林10 mg(/kg·d)静滴或喜炎平静滴抗病毒治疗1周。对于出现口腔溃疡的患者，用复方氯已啶清洗口腔，康复新喷剂促进口腔溃疡愈合。对于体温升高超过38.5 ℃的患儿，对其进行物理降温，可口服布洛芬、对乙酰氨基酚溶液降温。患儿中需要进行母乳喂养的可以继续母乳喂养，对于无需母乳喂养的患儿保持食用清淡、易消化、维生素含量丰富的食物。

1.3 血清IL-6、IL-13水平的检测 采用ELISA法。对照组体检时及观察组患儿入院及住院期间抽血。实验步骤如下：①吸附：取血清样品、空白对照和R&D公司试剂盒所配的系列标准溶液各100 μL，加入反应板的孔中，于37 ℃培养箱孵育90 min，弃去反应板各孔中溶液，分别加入洗涤液250 μL，振荡1 min，弃去洗涤液，按此重复共4次；②加抗体：将生物素化抗体工作液加入各孔中，100 μL/孔，37 ℃培养箱中孵育60 min后，洗板4次；③加底物：加入酶联底物溶液100 μL/孔，37 ℃培养箱中孵育30 min；洗板4次；④显色：加入显色剂100 μL/孔，避光37 ℃下孵育15 min，加入终止液100 μL/孔。用FC酶标仪450 nm波长下测定吸光度值。

1.4 细胞中IL-6和IL-13表达的检测 将肝素钠抗凝的全血样本用Ficoll密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞，将细胞加入RPMI 1640完全培养基(含10% FBS，200 IU/mL rhIL-2)中，制备成浓度为2×106/mL的细胞悬液。外周血单个核细胞用100 ng/mL PMA和1 μg/mL离子霉素刺激1 h后，加入高尔基体阻断剂，保持细胞因子在细胞中，不被转运出细胞外，孵育5 h。收集细胞，先加入表面染色的单抗试剂，用CD14圈定单核细胞和CD3圈定T细胞，细胞膜固定透化后加入IL-6和IL-13的荧光标记抗体，固定细胞膜通透性后，用流式细胞仪对上述样品进行分析。

1.5 EV71感染阳性细胞中IL-6和IL-13水平的检测 EV71病毒以MOI=5的条件感染1×107的健康人的单核细胞和T细胞，RT-PCR鉴定感染成功的单核细胞和T细胞[3]。用流式细胞术测被感染细胞的IL-6和IL-13水平，以正常的单核细胞和T细胞作为阴性对照。

2 结果

2.1 观察组患儿治疗前后血清IL-6和IL-13水平比较 观察组临床Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期治疗前血清IL-6水平分别为(50.62±4.21)、(74.79±8.53)、(96.41±10.63)pg/mL，治疗后分别为(24.31±6.59)、(41.09±8.64)、(68.09±15.37)pg/mL，对照组为(21.71±5.72)pg/mL；观察组临床Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期IL-13水平分别为(24.62±3.57)、(38.51±5.48)、(48.74±4.87)pg/mL，治疗后分别为(10.36±3.58)、(18.69±5.60)、(21.07±5.25)pg/mL，对照组为(16.53±2.72)pg/mL。观察组治疗前血清中IL-6和IL-13水平与对照组相比升高(P均<0.01)。与治疗前比较，治疗后观察组不同分期患者血清IL-6和IL-13水平均下降(P均<0.01)。不同分期间，随着临床分期升高，血清IL-6、IL-13水平升高(P均<0.01)。

2.2 两组单核细胞中IL-6和T细胞中IL-13表达水平比较 观察组临床Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期及对照组单核细胞中IL-6水平分别为(10.44±6.29)、(13.16±13.14)、(12.41±11.61)、(2.01±0.35)pg/mL，T细胞中IL-13水平分别为(8.48±5.78)、(4.04±1.39)、(5.27±3.72)、(2.43±0.46)pg/mL。与对照组比较，观察组各分期单核细胞中IL-6和T细胞中IL-13表达水平均高(P均<0.05)。

2.3 EV71感染的细胞中IL-6和IL-13水平比较EV71病毒感染的单核细胞及阴性对照细胞IL-6水平分别为(1.56±0.35)、(0.36±0.14)pg/mL，IL-3水平分别为(1.82±0.75)、(0.57±0.26)pg/mL。EV71病毒感染单核细胞和T细胞后，其IL-6和IL-13水平高于阴性对照细胞(P均<0.05)。

3 讨论

HFMD是多种肠道病毒所致的传染性疾病，其多发于婴幼儿，最常见病毒包括肠道病毒EV71在内。其临床表现为口痛、厌食、低热,手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，多数患儿一周左右自愈，少数患儿将发展至心肌炎等严重疾病[2]。

既往研究表明，IL-6是一种单核细胞分泌的多功能炎性细胞因子，在多种病理过程中起作用[11]。当机体受到病毒感染时，IL-6血清浓度会上升。IL-6在炎症反应中有抗炎和致炎的双向作用，与其在机体中的含量水平相关[12]。Huang等[13]研究表明，小鼠被EV71感染初期会短暂出现IL-6、IL-10和IFN-γ水平升高。在使用靶向IL-6受体的抗体治疗，抑制IL-6参与的信号传导过程，EV71感染导致的组织损伤好转、血液中病毒数量下降、炎症水平降低[14]。说明IL-6可能参与了EV71感染致HFMD的病理过程[15]。IL-13主要由T细胞产生，参与炎症反应过程，促进B细胞增殖，抑制促炎细胞因子分泌[16]。EV71感染引起的肺水肿患者及小鼠模型均显示，受感染后血清IL-13水平升高[17，18]。观察组血清中IL-6和IL-13水平高于对照组，且随着HFMD临床诊断严重分级越高，血清中IL-6和IL-13水平越高。提示IL-6和IL-13可能参与了EV71感染导致的HFMD发生和发展过程。

观察组和对照组单核细胞 中IL-6和T细胞中IL-13水平高于对照组。结合观察组血清中IL-6和IL-13水平偏高的测定结果，说明可能是因为单核细胞和T细胞分泌IL-6和IL-13增多，导致血清中其水平的升高。通过EV71体外感染健康人的单核细胞 和T细胞，测定结果显示细胞中IL-6和IL-13表达水平升高。说明EV71导致HFMD的一个途径是，通过促进单核细胞和T细胞表达IL-6和IL-13细胞因子，升高血清中IL-6和IL-13水平，进而导致HFMD患者出现炎症加重的临床病症。Huang等[13]研究表明，EV71感染后T淋巴细胞瘤(Jurkat细胞)分泌IL-2、IFN-ɑ、IL-6和IL-10的能力下降。本研究结果与其不同。推测可能的原因是Huang 等试验是通过ELISA法测定培养48 h后细胞因子的总量，EV71感染Jurkat细胞会导致细胞凋亡，如果48 h后以样品组与对照组中IL-6和IL-13的测得浓度来对比细胞因子的表达水平，会因为细胞数量的差别而有所差异。故本研究采用流式细胞术测定细胞内IL-6和IL-13表达水平，通过比较单核细胞和T细胞的数量，以及IL-6和IL-13的水平来排除其他因素的干扰。

综上所述，EV71感染导致HFMD，可能的途径是通过感染单核细胞和T细胞,促进其分泌IL-6和IL-13，引起血清中IL-6和IL-13的水平升高，但是其分子机理仍有待进一步研究。

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