E1A基因对三阴乳腺癌细胞侵袭迁移的影响及机制

邰亦成，方琦，谈珂岚，黄贵，张凌焱

(1常州市第一人民医院，江苏常州213000;2杭州市下沙医院妇产生殖中心)

E1A基因对三阴乳腺癌细胞侵袭迁移的影响及机制

邰亦成1，方琦1，谈珂岚1，黄贵1，张凌焱2

(1常州市第一人民医院，江苏常州213000;2杭州市下沙医院妇产生殖中心)

目的 探讨E1A基因对三阴乳腺癌(TNBC)细胞侵袭迁移的影响及机制。方法 采用脂质体转染法将E1A真核表达载体(pcDNA3.0-E1A)(E1A稳转克隆组)、pcDNA3.0空载质粒(空载克隆组)转染至TNBC MDA-MB-231细胞中，G418筛选得到E1A稳定过量表达的细胞克隆，以未转染质粒的MDA-MB-231细胞为空白对照组。采用Western blotting法对稳转克隆进行鉴定。细胞划痕试验检测各组细胞的迁移能力，Transwell小室试验检测各组细胞的侵袭能力，Western blotting法检测各组细胞中HSPA5蛋白表达水平。结果 G418筛选建立稳定转染pcDNA3.0-E1A质粒的MDA-MB-231细胞克隆(E1A稳转克隆)。与空白对照组和空载克隆组相比，E1A稳转克隆组的细胞迁移和侵袭能力均降低(P均<0.05),细胞HSPA5蛋白表达水平下降(P均<0.05)。结论 E1A基因能够明显抑制TNBC细胞的侵袭迁移，其机制可能与EA1促进HSPA5蛋白降解有关。

三阴乳腺癌；E1A；细胞侵袭；细胞迁移

乳腺癌是一种高度异质性疾病，是女性常见恶性肿瘤。我国的乳腺癌发病率呈逐年升高趋势，严重威胁着女性健康。根据不同的分子表型，乳腺癌可分为不同的亚型，其中三阴乳腺癌(TNBC)是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)均不表达的乳腺癌，约占总乳腺癌的15%[1]，因其ER表达阴性，TNBC患者并不能受益于内分泌治疗，而针对HER2的靶向治疗在TNBC患者的治疗中也无法发挥作用[2]。TNBC具有发病年龄早、易发生远处转移、恶性程度高以及预后差等特征。肿瘤细胞发生侵袭迁移是导致乳腺癌患者不良预后甚至死亡的重要原因之一，且是目前临床上难以克服的难点，探寻导致乳腺癌发生侵袭迁移的内在机制，寻找能够预测、甚至逆转肿瘤侵袭迁移的生物靶标，是临床上亟待解决的问题[3]。腺病毒5型早期区E1A基因在多种肿瘤中扮演着抑癌基因角色，如前列腺癌[4]、膀胱癌[5]等。目前关于E1A基因的研究主要集中在增强肿瘤化疗敏感性方面，如E1A能够增强顺铂、紫杉醇对肿瘤细胞的毒性作用[6],而关于E1A基因在乳腺癌中的研究相对较少。2016年4月～2017年3月，本研究通过在TNBC细胞中稳定表达E1A基因，检测E1A基因对TNBC细胞迁移和侵袭能力的影响，并进行初步的机制探讨。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂、仪器及其来源 TNBC MDA-MB-231细胞购自中国上海科学院细胞库，生长于DMEM培养基(含10% FBS，10×104U/L青霉素，100 mg/L链霉素)中，37 ℃、5% CO2条件下培养。胎牛血清(FBS)购自美国Thermo公司，青霉素、链霉素购自美国Sigma公司，Lipofectamine 3000、BCA蛋白定量试剂盒均购自美国Thermo公司，鼠抗人单克隆腺病毒5型E1A抗体(ab31686)、鼠抗人单克隆HSPA5/GRP78 BIP抗体(ab201708)均购自美国Abcam公司，鼠抗人β-actin抗体、HRP标记的羊抗鼠二抗均购自南京凯基生物科技发展有限公司，ECL发光液购自美国Millipore公司，凝胶成像仪购自美国UVP公司，显微镜(BX61)购自日本Olympus公司。

1.2 pcDNA3.0-E1A重组质粒的构建及分组 从GeneBank中调取E1A基因的编码区碱基序列(YP_068018.1)，PCR扩增，经BamHI和EcoRI酶切后，插入pcDNA3.0真核表达载体(含有NEO真核抗性基因)，经酶切、PCR和测序鉴定，构建pcDNA3.0-E1A真核表达载体。采用脂质体Lipofectamine 3000将pcDNA3.0-E1A质粒转染至MDA-MB-231细胞中，采用G418筛选稳转克隆的方法[7]，得到稳定表达pcDNA3.0-E1A质粒的细胞克隆，即E1A稳转克隆组；同时，转染pcDNA3.0空载质粒至MDA-MB-231细胞中，G418筛选得到稳转克隆，即空载克隆组；以未转染质粒的MDA-MB-231细胞为空白对照组。

1.3 细胞迁移能力检测 采用细胞划痕试验。取处于对数生长期细胞5×105～7×105个，接种于6孔板中，24 h后，细胞汇合度达90%以上；使用移液器枪头，垂直于6孔板底部，均匀地划线，每孔3条平行线；PBS洗涤3次，去除漂浮细胞，加入无血清DMEM培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中正常培养，分别于0、16 h时显微镜(400倍)下拍照，并计算细胞间距离。

1.4 细胞侵袭力检测 采用Transwell小室试验。Transwell小室置于24孔板中，在小室的聚碳酸酯膜上加入4.0 μg/μL Matrigel基质胶50 μL，37 ℃、5% CO2培养箱中过夜，使Matrigel基质胶凝固；在24孔板下室中加入含10% FBS的DMEM培养液500 μL，Transwell小室中加入细胞悬液(细胞总数约1×105个)150 μL；48 h后去除24孔板下室中的培养液，棉签擦去Transwell小室内室膜上的细胞，结晶紫溶液(0.1%)染色，室温5 min，显微镜(400倍)下观察，每孔随机选取3个视野拍照，并进行细胞计数。

1.5 细胞中HSPA5蛋白表达水平检测 采用Western blotting法。胰酶消化后收集各组细胞，RIPA蛋白裂解液抽提全蛋白样品，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。10% SDS-PAGE胶电泳分离蛋白后，湿转法将蛋白转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温振荡封闭2 h，TBST洗膜，然后分别用腺病毒5型E1A抗体、HSPA5/GRP78 BIP抗体、和β-actin抗体，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入HRP标记的羊抗鼠二抗,室温孵育1 h，加ECL发光液(进行化学发光显影，凝胶成像仪观察蛋白条带。实验重复3次。结果用Image J图像软件进行灰度分析。

2 结果

2.1 E1A基因表达的鉴定 TNBC MDA-MB-231细胞中，没有内源性E1A蛋白表达，而当pcDNA3.0-E1A质粒被成功转染到细胞中后，E1A在MDA-MB-231细胞中能稳定表达。

2.2 E1A基因对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响 空白对照组的划痕愈合率(102.48%±6.59%)与空载克隆组的划痕愈合率(98.38%±5.47%)之间差异无统计学意义(P>0.05)；E1A稳转克隆组的划痕愈合率(28.42%±2.32%)低于空白对照组和空载克隆组(P均<0.05)。

2.3 E1A基因对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响 空白对照组的迁移细胞数[(48.92±8.37)个/HP]和空载克隆组的迁移细胞数[(45.72±9.72)个/HP]之间差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组和空载克隆组相比，E1A稳转克隆组的迁移细胞数[(6.33±2.48)个/HP]减少(P均<0.05)。

2.4 各组HSPA5蛋白表达水平比较 HSPA5蛋白在E1A稳转克隆组的相对表达量为0.21±0.08，显著低于空白对照组(1.03±0.11)和空载克隆组(0.99±0.09)(P均<0.05)，而空白对照组与空载克隆组之间差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

在乳腺癌细胞中，E1A能够增强肿瘤细胞对EGFR-TKI的敏感性，从而能够有效地抑制肿瘤生长，而在前列腺癌的临床治疗中，以溶瘤腺病毒为载体的E1A基因靶向治疗已经进入临床前试验阶段。E1A参与调控多种基因的表达进而影响它们的功能，如E1A能够通过靶向p300和TRRAP，抑制MYC启动子区组蛋白H3K18和H4K16的乙酰化，进而抑制癌基因MYC的转录翻译，发挥抑癌功能。E1A基因在肿瘤细胞的增殖、凋亡、化疗耐药以及侵袭迁移中，均具有极其重要的作用。在卵巢癌细胞中，E1A通过抑制依赖ERK的转录过程，从而抑制细胞增殖；E1A可以通过抑制p21和MDM2进而促进p53诱导的细胞凋亡；此外，E1A还可以通过诱导DNA损伤应答导致BCL-2家族成员降解以及p53聚集，从而激活促凋亡信号通路，促进细胞凋亡。E1A基因在逆转肿瘤化疗耐药中占有极其重要的地位，如在对铂类化疗耐药的卵巢癌细胞中，E1A能够通过提高野生型p53蛋白的稳定性，显著抑制细胞增殖并且增强细胞凋亡，从而逆转化疗耐药；E1A能够通过抑制FOXO3a磷酸化过程，从而增强肿瘤细胞对紫杉醇的化疗敏感性。

E1A能够抑制肿瘤侵袭迁移过程，如E1A干扰CtBP与Zeb-1之间的相互作用，从而激活E-cadherin的蛋白表达，抑制肿瘤细胞侵袭迁移过程[8]；E1A是Axl信号通路的负调控因子，而Axl信号通路下游信号分子，如Akt和NF-κB等在肿瘤侵袭迁移过程中发挥促进作用，故E1A可以通过抑制Axl信号通路进而抑制肿瘤细胞侵袭迁移过程[9]。

E1A基因在乳腺癌细胞迁移和侵袭过程中的功能，相关的文献报道却较少，如在HER2表达阳性的乳腺癌细胞MCF-7中，E1A可以抑制HER2/neu基因的转录翻译，从而抑制肿瘤细胞发生侵袭迁移[10]。本研究结果发现，E1A稳转克隆细胞的迁移和侵袭能力均降低，提示E1A能够抑制TNBC细胞的迁移侵袭能力。Su等[11]的研究发现，体外试验中，E1A能够通过表观遗传修饰的方式,特异性抑制miRNA-520h，从而抑制乳腺癌细胞侵袭迁移能力；Chang等[12,13]的研究发现，在乳腺癌细胞中，E1A能够诱导HSPA5蛋白发生去乙酰化进而被泛素化降解，从而抑制肿瘤细胞的侵袭迁移过程。HSPA5属于HSP蛋白家族成员之一，参与促进多种肿瘤的侵袭迁移过程，如HSPA5基因转录激活后，能够促进结直肠癌细胞发生侵袭和迁移[14]。本研究发现，伴随着细胞侵袭迁移能力的减弱，E1A稳转克隆细胞内HSPA5蛋白表达水平也明显下降，提示E1A基因能够抑制TNBC细胞的侵袭迁移能力，可能与E1A促进HSPA5蛋白降解有关。

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Effects of E1A gene on migration and invasion of triple-negative breast cancer cells

TAIYicheng1,FANGQi,TANKelan,HUANGGui,ZHANGLingyan

(1TheFirstPeople′sHospitalofChangzhou,Changzhou213000,China)

Objective To investigate the effects of E1A gene on the migration and invasion of triple-negative breast cancer (TNBC) cells and is mechanism. Methods The eukaryotic expressive vector containing E1A gene (pcDNA3.0-E1A) (E1A stable clone group) and pcDNA3.0 empty plasmid (empty-plasmid clone group) were separately transfected into MDA-MB-231 cells by the lipofectamine, and stable E1A positive clones were selected by G418. Meanwhile, the MDA-MB-231 cells without any transfection were taken as the blank control group. Then Western blotting was utilized to identify the stable clones. The migration and invasion abilities of cells in all groups were analyzed by Scratch test and Transwell assay, respectively. Besides, the protein level of HSPA5 in all groups was detected by Western blotting.Results MDA-MB-231 cell clones stably transfected with pcDNA3.0-E1A plasmid (E1A clones) were successfully established by the G418. The cell migration and invasion abilities of E1A clones in the E1A stable clone group were much lower as compared with those of the blank control group and the empty-plasmid clone group (P<0.05), accompanied by the down-regulated expression of HSPA5 protein (allP<0.05). Conclusion E1A gene can significantly inhibit the cell invasion and migration of TNBC cells in vitro by E1A promoting the protein degradation of HSPA5.

triple-negative breast cancer; E1A; cell invasion; cell migration

江苏省科学技术厅科技成果(20150014)；常州科技计划项目 (CJ20140028)。

邰亦成(1983-)，女，主治医师，主要研究方向为乳腺外科疾病的诊断治疗。E-mail：taiyicheng_1983@126.com

张凌焱(1982-)，女，主治医师，主要研究方向为妇科生殖性疾病的诊断治疗。E-mail：fangqi_1972@medicinepap.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.29.007

R737.9

A

1002-266X(2017)29-0023-03

2017-06-06)