细胞凋亡途径的研究进展

李帅，张炳东

(广西医科大学第一附属医院，南宁530000)

细胞凋亡途径的研究进展

李帅，张炳东

(广西医科大学第一附属医院，南宁530000)

细胞凋亡是一种自然现象，在多细胞生物的生长、发育和死亡等过程中都存在，其发挥着及时清除机体内受损和(或)多余细胞的作用，以维持组织器官及内环境的稳态。真核细胞主要通过死亡受体介导的外源性凋亡通路、细胞线粒体介导的内源性凋亡通路、穿孔素/颗粒酶介导的细胞凋亡通路及近几年关注的细胞内质网应激介导的凋亡通路等途径发生凋亡。

细胞凋亡；外源性信号通路；内源性信号通路；穿孔素/颗粒酶凋亡信号通路；内质网应激

细胞凋亡是一种自然现象，在多细胞生物的生长、发育和死亡等过程中都存在，其发挥着及时清除机体内受损和(或)多余细胞的作用，以维持组织器官及内环境的稳态。真核细胞主要通过死亡受体介导的外源性凋亡通路、细胞线粒体介导的内源性凋亡通路、穿孔素/颗粒酶介导的细胞凋亡通路及近几年开始关注的细胞内质网应激(ERS)介导的凋亡通路等机制发生凋亡。随着进一步深入研究发现，细胞凋亡对体外循环引起的脑损伤也产生影响。本文对细胞凋亡途径作一综述。

1 细胞凋亡概述

细胞的死亡方式大致可分为两种：坏死与凋亡。细胞坏死通常是由于恶劣的外界因素(高温、缺氧、营养物质缺如及多种物理或生化物质等)导致的被动死亡过程；细胞凋亡实质是一种正常的自然现象。研究发现，细胞凋亡不同于被动的病理性坏死，它是细胞在正常生存过程中受基因控制的一种程序化自主性消融过程，因此细胞的这种死亡过程又被称为“程序化的细胞死亡”[1]。1972年Kerr等[2]首次对此现象下了定义，提出“凋亡”一词。凋亡来源于希腊语，意为“远离”。细胞凋亡对于多细胞生物个体生长发育的正常进行，自稳平衡的保持，抵御外界各种因素的干扰及在胚胎发育、造血、免疫系统的成熟，还有维护正常组织和器官的细胞恒定与生长平衡、乃至机体衰老方面都起重要作用。异常调控细胞凋亡与疾病的发生发展有关，如阿尔茨海默病、中风、艾滋病和癌症[3]。对神经系统发育进行研究时发现，在大多数动物中，最初产生的神经元数量要高于与成熟脑回路所结合的神经元数量，提示大量神经元的消除是通过细胞凋亡这种特殊的方式[4]。

凋亡细胞的形态学特点包括：凋亡细胞呈圆形或卵圆形，有暗嗜酸性的细胞质和致密的紫色核染色质碎片。早期胞质浓缩、细胞体积缩小，细胞质密度更大，细胞器更紧密，细胞核收缩，染色质在核膜下发生聚集。核内染色质凝聚是凋亡最典型的特征。随后细胞核破裂，大量胞质膜起泡形成质膜小包，膜结构逐渐发生变化，质膜小包包裹着破裂的细胞核和细胞碎片形成凋亡小体，这一过程被称为“出芽”。线粒体溶酶体等细胞器在此过程中均无破裂。接着这些凋亡小体被巨噬细胞、薄壁细胞或者肿瘤细胞识别并吞噬，然后在这些细胞体内降解。这种在滤泡生发中心或胸腺皮层内发现的，具有识别、吞噬和消化凋亡细胞的巨噬细胞被称为“着色体的巨噬细胞”。在发生细胞凋亡和清除凋亡小体的整个过程中均不会发生炎症反应，这是因为：细胞凋亡的发生往往是单个而不是连接成群；凋亡过程中，膜的完整性还在，凋亡细胞的胞内物质并没有外溢；产生的凋亡小体迅速被周围相关细胞识别并吞噬。细胞的生化特征：在凋亡过程中，细胞内Ca2+和Mg2+浓度升高，由于特定的内源性核酸内切酶的活化，使DNA在核小体连接区出现了断裂，形成以180～200 bp核小体为基本单位的DNA片段。用苯酚除去组蛋白后，经1.8%琼脂糖凝胶进行电泳分离，则会呈现出凋亡细胞低分子量DNA片段的特异阶梯模式，这是区分存活细胞和死亡细胞的特有现象。

2 细胞凋亡途径

细胞凋亡是一个极其复杂的、精确调控的、蛋白酶依赖的分子级联反应过程。目前，存在两种主要的细胞凋亡途径，包括外源性(死亡受体介导凋亡)信号通路、内源性(细胞线粒体介导凋亡)信号通路。这两种主要途径是有关联的，互相影响[5]。另外，还有一种细胞凋亡途径--穿孔素/颗粒酶介导信号通路，由具有细胞毒性的T细胞介导对细胞有穿孔性的死亡途径，主要通过颗粒酶A或颗粒酶B导致细胞凋亡。虽然上述三种导致细胞凋亡的信号通路不尽相同，但是最后都会由相同的凋亡执行信号通路(半胱天冬氨酸蛋白酶家族激活)来完成凋亡。除以上三种比较经典的细胞凋亡途径外，近年来还发现，ERS也会引起细胞凋亡。ERS主要通过调节Bcl-2家族相关促凋亡因子和(或)抑凋亡因子、调节内质网(ER)上的Ca2+等方式导致细胞发生凋亡，故可将ERS引起的细胞凋亡视作是细胞线粒体凋亡途径的完善[6]。大多数细胞中Caspase以失活的酶原形式广泛表达，一旦被活化就能通过活化自身和(或)其他Caspase酶原，从而启动相关蛋白酶的级联反应，放大凋亡信号，以此导致细胞快速死亡。Caspase酶级联反应似乎是一个不可逆的过程，一旦开始最终都会导致细胞死亡。到目前为止，已有十多种Caspase酶被发现，主要分为:启动因子Caspase酶(Caspase-2、8、9、10)、执行因子Caspase酶(Caspase-3、6、7)、炎症介导因子Caspase酶(Caspase-1、4、5)。凋亡启动因子被激活以后，通过各自介导Caspase酶级联反应依次激活凋亡执行因子，最终导致细胞凋亡，其中细胞凋亡的中心环节是Caspase-3的活化[7,8]。

2.1 外源性(死亡受体介导凋亡)信号通路 死亡受体介导凋亡信号通路是一种通过跨膜受体介导的蛋白发生相互作用的信号通路。死亡受体属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，其胞外是富含半胱氨酸的重复序列，胞内则有称为死亡结构域(DD)的大约80种氨基酸残基的蛋白结合域，该功能域能特异性地与其配体相结合继而诱导凋亡。TNFR超家族主要包括Fas、TNFR-1、TNFR-2、DR3、DR4、DR5等。直至目前，研究最为详尽的死亡受体介导凋亡信号通路是Fas/FasL模型，其机制大致是：Fas与FasL结合后被激活，活化的Fas受体通过DD的相互作用招募胞质中的Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)，FADD既可以通过C端的DD结合Fas，又可以通过N端的死亡效应结构域(DED)来募集半胱天冬酶8酶原(procaspase-8)，最后形成Fas受体-FADD-procaspase-8死亡诱导信号复合体(DISC)。随着研究的深入，Schleich等[9]发现，DISC由CD95、FADD、procaspase-8、procaspase-10和细胞抑制剂等组成，在DISC上还生成1个procaspase-8 prodomain，对procaspase-8激活形成了一个负反馈调节机制。随着DISC局部浓度增高，procaspase-8在DISC中自我催化成具有活性的Caspase-8，随后激活下游的Caspase因子，从而启动依赖Caspase酶级联反应的细胞凋亡过程[10]。

2.2 穿孔素/颗粒酶凋亡信号通路 T细胞介导的细胞毒性作用是Ⅳ型过敏反应的一种变体，通过激活CD8+细胞可以杀死携带特异抗原的细胞。一方面，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)能够通过外源性信号通路杀伤靶细胞，而Fas/FasL途径是CTL诱导细胞凋亡的主要方法。另一方面，CTL能够通过对肿瘤细胞和病毒感染细胞产生细胞毒性作用，即CTL生成的穿孔素作用于细胞膜，使其产生“空隙”，然后向胞内释放细胞质颗粒，颗粒酶A和颗粒酶B就是这些细胞质颗粒的主要物质[11]。颗粒酶B所介导的细胞凋亡途径主要是经由激活Caspase-10和Caspase-7而诱导Caspase酶活化。蛋白酶抑制剂9是已知仅有的人类细胞内颗粒酶B抑制剂，其通过抑制自然杀伤细胞和CTL引起的细胞毒性，阻断穿孔素/颗粒酶凋亡信号通路，然后经Fas/FasL途径逐步抑制细胞凋亡[12]。而颗粒酶A所介导的细胞凋亡途径有两个特点：一个特点是非Caspase依赖的细胞凋亡；另一个特点是通过促进铁硫蛋白的裂解以紊乱线粒体的新陈代谢，从而产生活性氧(ROS)。ROS使ER关联的SET复合物到细胞核，SET复合物裂解并释放脱氧核糖核酸酶NM23-H1，使染色体DNA形成单链DNA切(缺)口而引起DNA断裂，最终引起靶细胞死亡[13]。同时，颗粒酶A还可以降解多种重要的蛋白质，如组成染色质基本结构的组蛋白，维持核膜稳定的核纤层蛋白以及DNA损伤修复的关键蛋白。

2.3 内源性(细胞线粒体凋亡)信号通路 参与细胞线粒体凋亡信号通路中的相关因子大多都定位于线粒体。当细胞受到各种刺激因子作用，如缺氧、癌基因被激活、DNA发生损伤、细胞营养因子缺乏等，会导致线粒体膜电位稳态被破坏、通透性增加，线粒体膜内的促凋亡因子释放到胞质，激活细胞线粒体凋亡途径，引起细胞死亡。促凋亡因子包括：细胞色素C(Cyt C)、凋亡诱导因子(AIF)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂(Smac/DIABLO)、凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)等。释放的Cyt C结合Apaf-1和Caspase-9形成“凋亡体”，进而激活Caspase-3最终引起细胞凋亡[14]。细胞线粒体凋亡信号通路主要通过调节Bcl-2蛋白家族来发挥功能，其主要机制是控制线粒体膜的通透性，以此来调节Cyt C的释放[15]。目前，发现了30多种Bcl-2家族成员，有抑制细胞凋亡的因子，主要包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-x、BAG等；有促进细胞凋亡的因子，主要包括Bax、Bid、Bak、Bad、Bcl-10、Bim等。这些因子在细胞线粒体凋亡信号通路中起着重要作用[16,17]。Chen等[18]通过增加Bcl-2、Mcl-1抑凋亡因子和(或)减少Bax和Bad促凋亡因子，减少了细胞线粒体凋亡信号通路的激活；而通过增加Bax/Bcl-2的表达，可激活细胞线粒体凋亡信号通路。除上述Cyt C介导的凋亡，细胞线粒体凋亡信号通路还有一种非Caspase依赖的凋亡途径，即由AIF介导的细胞凋亡。AIF正常情况下存在于线粒体内，当细胞受到内部凋亡因子刺激后，AIF可由线粒体释放，从细胞溶胶向细胞核转移，最终进入细胞核，导致DNA的破坏，引起细胞的死亡[19]。Shintani等[20]在研究细胞线粒体凋亡信号通路时发现，Smac/DIABLO、Omi/HtrA2等是凋亡因子抑制剂的拮抗物，这些因子的释放也能调节细胞凋亡。

2.4 ERS途径 ERS途径也是内源性凋亡信号通路。ER作为细胞内一种重要的细胞器，参与包括细胞内蛋白质合成后折叠、细胞对应激的反应等活动，同时也是Ca2+的最主要储存库。当Ca2+稳态发生改变、蛋白质出现未折叠和(或)错误折叠并在ER蓄积时，可以引发ERS，凡是影响ER结构和功能的因素都可以引起ERS，如缺乏营养物质、干扰蛋白质翻译、破坏ER内Ca2+平衡以及缺氧、病毒、药物等，严重时则能诱导细胞凋亡。为减轻ERS避免发生细胞凋亡，由此产生的后续反应称为未折叠蛋白反应(UPR)。ERS主要是通过三种信号传递因子激活级联反应诱导细胞凋亡，包括：PERK、IRE1α和ATF6[21]。这三种因子和BiP/GRP78组成稳定的混合物以防止UPR的发生，由此分为依赖BiP/GRP78激活UPR途径和非依赖BiP/GRP78激活UPR途径。Shima等[22]通过实验证明：可以通过增强BiP/GRP78的表达以减弱ERS，进而减少细胞凋亡的发生；同时也有实验证明：ATF6和PERK可被血管内皮细胞生长因子受体-磷脂酶Cγ-mTOR复合物1激活，以此诱导ERS，而IRE1α可通过活化的PI3K/AKT被激活[23]。IRE1α有双重性：有利方面，可通过降低蛋白质的合成，减轻蛋白质折叠的负担，以达到保护细胞的作用；不利方面则是会降解能编码促生存蛋白的mRNA[24]。ERS主要通过调节Bcl-2家族而引起细胞凋亡。最新研究发现，还可通过调控抗凋亡蛋白的转化效率来控制细胞凋亡，如使eIF2α大量磷酸化导致胞质异质性胞核核糖核蛋白A1积累，从而降低Bcl-xL等抗凋亡因子的表达效率，最终诱导细胞发生凋亡[25]。另外，Hacker[26]发现ERS还与炎症通路有关，ERS通过PERK和IRE1通路引起IL-1β的表达，IL-1β又正反馈调节ERS介导的β细胞死亡。

ROS和Ca2+是影响细胞凋亡的两个重要因子，高浓度ROS会促进ERS[27]。此外，当ERS激活JNK时，线粒体内的ROS会增加，最后诱导细胞凋亡，这可看作是两种凋亡途径的交叉。ER、线粒体和细胞核都是Ca2+的主要贮存库。当发生ERS时，ER会释放Ca2+来提升胞质内Ca2+浓度，线粒体内Ca2+浓度也会随之增加，Ca2+浓度不断增加，会使Ca2+调节网络超载导致线粒体功能障碍，最终发生细胞凋亡[28]。

细胞凋亡对维持机体正常生理功能具有重要作用。随着现代医学的发展，疾病和体外循环导致的相关器官损伤也引起了医学生物等多领域科研人员的重视。通过对细胞凋亡机制和相关疾病的发病机制的深入研究，对异常增殖和(或)异常凋亡的细胞进行有效干预，对相关疾病的防治有重要意义。

[1] Wu C, Zhang Y, Sun Z, et al. Molecular evolution of Cide family proteins: novel domain formation in early vertebrates and the subsequent divergence[J]. BMC Evol Biol, 2008,8:159.

[2] Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics[J]. Br J Cancer, 1972,26(4):239-257.

[3] Askew K, Li K, Olmos-Alonso A, et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain[J]. Cell Rep, 2017,18(2):391-405.

[4] Blanquie O, Kilb W, Sinning A. Homeostatic interplay between electrical activity and neuronal apoptosis in the developing neocortex[J]. Neuroscience, 2017,358:190-200.

[5] Fan D, Fan TJ. Clonidine induces apoptosis of human corneal epithelial cells through death receptors-mediated, mitochondria-dependent signaling pathway[J]. Toxicol Sci, 2017,156(1):252-260.

[6] 李敏,林俊.细胞凋亡途径及其机制[J].国际妇产科学杂志,2014,41(2):103-107.

[7] Larsen BD, Rampalli S, Burns LE, et al. Caspase 3/caspase-activated DNase promote cell differentiation by inducing DNA strand breaks[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010,107(9):4230-4235.

[8] 张朋云,陈淼.PI3K/AKT信号传导通路在急性肺损伤发生发展中作用的研究进展[J].山东医药,2016,56(45):99-101.

[9] Schleich K, Buchbinder JH, Pietkiewicz S, et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain[J]. Cell Death Differ, 2016,23(4):681-694.

[10] Singh N, Hassan A, Bose K. Molecular basis of death effector domain chain assembly and its role in caspase-8 activation[J]. FASEB J, 2016,30(1):186-200.

[11] Grossman WJ, Verbsky JW, Barchet W, et al. Human T regulatory cells can use the perforin pathway to cause autologous target cell death[J]. Immunity, 2004,21(4):589-601.

[12] Kurschus FC, Jenne DE. Delivery and therapeutic potential of human granzyme B[J]. Immunol Rev, 2010,235(1):159-171.

[13] Lieberman J. Granzyme a activates another way to die[J]. Immunol Rev, 2010,235:93-104.

[14] Yang YY, Yu YB, Wang JH, et al. Silica nanoparticles induced intrinsic apoptosis in neuroblastoma SH-SY5Y cells via CytC/Apaf-1 pathway[J]. Environ Toxicol Phar, 2017,52:161-169.

[15] Lu WN, Zheng FP, Lai DW, et al. Xuezhikang reduced renal cell apoptosis in streptozocin-induced diabetic rats through regulation of Bcl-2 family[J]. Chin J Integr Med, 2016,22(8):611-618.

[16] Oltersdorf T, Elmore SW, Shoemaker AR, et al. An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression of solid tumours[J]. Nature, 2005,435(7042):677-681.

[17] 汪枫,喻小兰,夏纪毅,等.黄芩素、LY294002对人肝癌细胞系SMMC-7721细胞增殖及凋亡的影响[J].山东医药,2016,56(41):1-5.

[18] Chen XP, Li SY, Zeng ZB, et al. Notch1 signalling inhibits apoptosis of human dental follicle stem cells via both the cytoplasmic mitochondrial pathway and nuclear transcription regulation[J]. Int J Biochem Cell B, 2017,82:18-27.

[19] Wiraswati HL, Hangen E, Sanz AB, et al. Apoptosis inducing factor (AIF) mediates lethal redox stress induced by menadione[J]. Oncotarget, 2016,7(47):76496-76507.

[20] Shintani M, Sangawa A, Yamao N, et al. Smac/DIABLO expression in human gastrointestinal carcinoma: association with clinicopathological parameters and survivin expression[J]. Oncol Lett, 2014,8(6):2581-2586.

[21] Liu Y, Jiang ZY, Zhou YL, et al. β-elemene regulates endoplasmic reticulum stress to induce the apoptosis of NSCLC cells through PERK/IRE1α/ATF6 pathway[J]. Biomed Pharmacother, 2017,93:490.

[22] Shima K, Klinger M, Schutze S, et al. The role of endoplasmic reticulum-related BiP/GRP78 in interferon gamma-induced persistent Chlamydia pneumoniae infection[J]. Cell Microbiol, 2015,17(7):923-934.

[23] Urra H, Hetz C. A Novel ER Stress-Independent Function of the UPR in Angiogenesis[J]. Molecular cell, 2014,54(4):542-544.

[24] Hassler J, Cao SS, Kaufman RJ. IRE1, a double-edged sword in pre-miRNA slicing and cell death[J]. Dev Cell, 2012,23(5):921-923.

[25] Su CM, Chen CY, Lu TT, et al. A novel benzofuran derivative, ACDB, induces apoptosis of human chondrosarcoma cells through mitochondrial dysfunction and endoplasmic reticulum stress[J]. Oncotarget, 2016,7(50):83530-83543.

[26] Hacker G. ER-stress and apoptosis: molecular mechanisms and potential relevance in infection[J]. Microbes Infect, 2014,16(10):805-810.

[27] Chaudhari N, Talwar P, Parimisetty A, et al. A molecular web: endoplasmic reticulum stress, inflammation, and oxidative stress[J]. Front Cell Neurosci, 2014,8:213.

[28] Son SM, Byun J, Roh SE, et al. Reduced IRE1α mediates apoptotic cell death by disrupting calcium homeostasis via the InsP3 receptor[J]. Cell Death Dis, 2014,5:1188.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.036

R329.2

A

1002-266X(2017)37-0103-04

广西壮族自治区重点研发计划项目(2016AB09002)。

张炳东(E-mail:zbdong2007@126.com)

2017-07-19)