乳牙牙髓干细胞最新研究进展*

陈文峰 石运芝

(泰山医学院口腔医学院,山东泰安 271000)

乳牙牙髓干细胞最新研究进展*

陈文峰 石运芝

(泰山医学院口腔医学院,山东泰安 271000)

乳牙牙髓干细胞;多向分化;组织再生

乳牙牙髓干细胞(stem cell from human exfoliated deciduous teeth，SHED)是由施松涛教授于2003年首次在脱落的乳牙中发现，后经Miura等人[1]证实， SHED具有较强增殖和多向分化潜能。迄今为止在口腔中已分离出五种牙源性干细胞：脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)，恒牙牙髓干细胞(dental pulp stem cell，DPSC)，牙囊干细胞(dental follicle stem cell，DFSC)，牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell，PDLSC)。而SHED易于操作，不存在免疫和排斥反应，在组织工程学中作为种子细胞越来越受关注。本文就乳牙牙髓干细胞的最新研究进展、临床前应用、未来前景等做一综述。

1 乳牙牙髓干细胞的生物学特性

SHED起源于神经嵴，存在于牙髓血管周围，可被诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、软骨细胞、心肌细胞、皮肤细胞和成牙本质细胞。在适宜的条件下，SHED表达间充质细胞特异性标记物如CD105、CD90、CD146、CD44，也表达多种生长因子(FGF、TGF-β，CTGF，NGF，BMP)，还参与细胞增殖和细胞外基质的形成，但不表达造血干细胞标记、淋巴细胞或白细胞抗原[1]。

在儿童及青少年脱落的乳牙中含有丰富的SHED，最近的研究表明：SHED具有多向分化潜能，可治疗包括系统性红斑狼疮、缺血性脑损伤、脊髓损伤和肌萎缩等动物模型的疾病[2-4]，相比其他干细胞SHED无论在分离培养和诱导分化上都较为可行，现将其优点通过比较列举如下：

1.1 乳牙牙髓干细胞相比胚胎干细胞的优点

就取材方面考虑，SHED来源广且成本低，人类共有20颗乳牙，在生长发育过程中，可从自然脱落的乳牙中获得，这比从骨髓中穿刺提取骨髓干细胞方便得多且成本和准备时间大大降低。伦理道德方面，乳牙牙髓干细胞不存在伦理道德的争议，这是相对胚胎干细胞的一大优点。SHED安全风险低，干细胞治疗必须克服肿瘤的发生和强烈的免疫反应，而到目前为止，移植乳牙牙髓干细胞没有畸胎瘤或癌症等形成报告。此外就增殖和分化潜能方面，很多研究表明乳牙牙髓干细胞具有较高的增殖率，不论在表达神经干细胞标志物，还是基因编码的细胞表面蛋白水平都高于胚胎干细胞。

1.2 乳牙牙髓干细较其他牙源性干细胞的优点

首先SHED较DPSC、PDLSC易得且创伤小。其次，SHED具有更好的增殖和分化特性。第三，低温冷冻保存乳牙较恒牙更为可行。Lindemann等人[5]研究发现在脱落的乳牙中，由于牙根吸收牙髓腔暴露，低温保护剂更易吸收。而对于保存完整的恒牙，由于根尖孔较乳牙狭窄冷冻保护剂不易渗入牙髓中，冷冻保存的效果不及乳牙。因此，脱落乳牙在牙齿干细胞保存中有较好的应用前景。

2 SHED在临床前疾病治疗应用进展

随着人类对SHED的深入研究，越来越多临床前动物模型实验研究证明SHED在治疗阿兹海默病、帕金森病、急性炎症、糖尿病等动物实验模型疾病中具有显著疗效[6-9]。

2.1 SHED与神经系统疾病

SHED具有良好的神经分化功能，在含有生长因子培养基中，SHED可失去成纤维细胞外观而获得神经形态，并且随时间延长βIII-tubulin、NeuN、NFM等神经细胞表达水平增加。Morsczeck等[10]在对SHED进行神经分化研究发现，相比DPSC和DFSC，SHED无论是在自发或有化学诱导剂(维甲酸、二甲基亚砜)存在情况下神经分化时间总比DFSC快4倍左右，同时发现在这3种标准培养基中有相似的生物学形态和干细胞标记物表达，但只有SHED表达视网膜干细胞标志物(Pax6)，这可能提示SHED有更好的神经细胞分化潜能。

在适当的条件下SHED可以分化为有功能的神经元和少突胶质细胞，将这些细胞移植到动物模型中可缓解各种急慢性中枢神经系统损伤。SHED分离培养主要集中在酶消化法上，王劲松[11]用此法培养SHED至第3代时，在加入神经干细胞的特殊培养基中SHED可分化形成神经球，并经Real-Time PCR检测，发现诱导后的细胞随着时间延长胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和脑源性神经营养因子浓度明显增高。在此基础上，Hiromi等[7]用表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子信号通路激活SHED表达原神经基因，待分化成熟为黑质纹状体多巴胺神经元(dsheds)时，移植到帕金森病大鼠模型中，与接受PBS或移植成纤维细胞模型的大鼠对比发现，接受SHED的大鼠行为学有显著改善。这一结论为应用SHED进行帕金森病研究提供了基础。

与帕金森病相似的阿兹海默病(AD)都是渐进性神经退行性疾病，和帕金森病不同的是AD的特点是认知能力下降和大脑中出现β-淀粉样蛋白斑块。Tsuneyuki等[6]对SHED、人骨髓间充质干细胞(BMSC)和人皮肤成纤维细胞在AD小鼠模型认知能力的改善中比较发现：接受SHED无血清培养液的小鼠表现出认知能力显着提高，而接受BMSC和成纤维细胞的对照组则改善不明显。由此表明SHED能改善小鼠模型认知功能障碍。进一步研究发现，SHED、BMSC、纤维培养液都能抑制AD小鼠3-硝基酪氨酸和一氧化氮合成酶II的产生，但是SHED能将小鼠促炎性脑环境转化为抗炎性脑环境，其中抗炎因子IL-10出现高表达。此外SHED增加了脑源性神经营养因子和胰岛素样生长因子的表达，同时SHED抑制谷氨酸活性，对谷氨酸神经毒性起到保护作用。

还有研究表明SHED在脊髓损伤修复中发挥着独特效果。早在三十年前就有研究BMSC治疗脊髓损伤动物模型，但培养BMSC需进行骨髓穿刺，这就会引发感染和疼痛等危险。SHED的移植治疗在很大程度上可解决这一问题。Sakai等[12]在研究大鼠脊髓完全横断模型实验中发现，接受SHED的大鼠运功恢复情况明显高于接受移植的BMSC和皮肤来源的成纤维细胞的大鼠，并提出了SHED用于神经再生活性的三个主要机制：(1)抑制神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞的凋亡，从而提高对神经纤维和髓鞘的保护；(2)恢复切断轴突的再生通过直接抑制多个轴突的生长抑制因子，包括硫酸软骨素蛋白多糖和髓鞘相关糖蛋白；(3)取代丢失或损伤的细胞通过分化为成熟的少突胶质细胞等。

2.2 SHED与免疫系统疾病

近年来研究发现SHED除有多向分化潜能外，还具有较好的免疫调控作用。在对SHED、DPSC、DFSC的免疫特性比较发现，三者都能够抑制淋巴细胞增殖，增加调节性T细胞和IL-10水平，降低IL-4和 IFN-γ水平。在免疫调节能力上SHED略低于DFSC，但 SHED表达Fas的配体(CD178)可显著抑制IFN-γ刺激，降低炎症反应[13]。基于SHED在动物模型的研究基础上，目前已较多应用于急性炎症、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)等临床前实验中。

在SHED、BMSC移植治疗SLE小鼠模型中，对免疫功能及疗效恢复情况发现，移植SHED的小鼠能降低自身抗核抗体水平，降低外周免疫球蛋白，如IgG1、IgG2a、IgM，改善肾功能，延长其寿命。进一步研究发现，SHED相对于BMSC在上调T细胞，减少外周血Th17细胞水平中发挥着显著的免疫调节作用[2]。

炎症反应伴随者免疫应答，大量的研究发现SHED在一定程度上可抑制炎症反应，加强免疫应答。Ugne等人[8]在研究SHED和糖皮质激素在抑制小鼠急性炎症模型发现，SHED和糖皮质激素都具有明显的抗炎作用，但在体内成像实验显示两者炎性蛋白酶失活动力学存在显著差异，这一结果提示SHED和糖皮质激素有不同的抗炎模式。糖皮质激素抑制炎症经典机制是抑制磷脂酶A2(PLA2)和环氧化酶2(COX2)合成的前列腺素和白三烯等。PLA2通路抑制作用是通过增加膜联蛋白A1的合成与功能实现的。而与此不同的是，SHED分泌因子中携带GTP激活磷脂酶和脂质介质，运输的PLA2和脂质介质到达炎症部位可能是外来抗炎作用的另一机制。这一发现和Hirotaka等人[14]研究结果相似，他们将SHED无血清培养液注射到博莱霉素(BLM)诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)的模型中，实验发现可减轻小鼠肺部的炎症而提高小鼠生存率。但目前对SHED通过什么介质影响PLA2、COX2和iNOS的信号分子通路存在这很大争议，这提示着未来的研究方向将会更多关注在SHED如何影响PLA2、COX2的表达和急性炎症部位iNOS的信号通路。

2.3 SHED与成牙及成骨

过去的相关鉴定结果表明，SHED在体外可分化为成牙本质细胞和诱导宿主产生成骨细胞。对此功能，有关学者又进行了深入的研究。Bakopouioub等[15]研究发现随SHED分离方式不同其形成的牙本质也有差别。SHED通过酶降解法分离后能迅速产生矿化组织，但矿化组织仍保留SHED的梭形形态，而对SHED直接生长后的产物进行分离培养，尽管矿化速率较低，但获得了功能性成牙本质细胞。这一结果表明直接培养法在SHED形成牙本质中较为可行。与DPSC不同的是SHED只能形成牙本质样结构但不能形成牙本质-牙髓复合体。基于这些研究任飞等人[16]通过转化生长因子β3(TGF-β3)联合肝素对SHED进行体外培养实验结果发现：实验组碱性磷酸酶9(AKP)活性明显增强，14天时在镜下观察到黄褐色结晶，28d时茜素红染色表现为强阳性矿化结节，提示成牙本质细胞特异性标志物(牙本质涎磷蛋白基因)及其基因表达产物(牙本质涎蛋白)明显增高，从而进一步证明TGF-β3联合肝素可促进SHED形成牙本质分化。

成骨方面的研究，从早期单纯骨细胞的诱导，到目前动物模型的骨缺损修复，大量的实验研究证明SHED具有骨诱导能力，为下一步开展临床治疗奠定了基础。Takahash等人[17]在比较SHED和DPSC成骨能力时发现：两者N-钙黏着蛋白表达水平相差不多，而R-钙黏着蛋白水平DPSC明显高于SHED。由于R-钙黏着蛋白的表达与成骨分化的状态有关，DPSC中表达R-钙黏着蛋白水平而不表达成骨细胞特异性标志物(成骨相关转录因子抗体和骨钙素)使得SHED比DPSC更能够分化为成骨细胞。因此作者认为R-钙黏着蛋白的表达限制了DPSC的多向分化潜能。

2.4 SHED在其他疾病中的作用

SHED与糖尿病：乳牙牙髓干细胞在多向分化的基础上有望对糖尿病的治疗开辟一条新途径。石建峰等人[9]通过重组转录因子慢病毒载体Lenti-hFOXA2和Lenti-hPDX1诱导SHED，经免疫荧光染色显示细胞中有胰岛素原、转录因子表达，在经过高糖培养液培养后细胞中的胰岛素原进一步转化为胰岛素。此试验证明诱导后的SHED细胞具有β细胞的相关特性，有望为糖尿病基因治疗带来种子细胞。对此功能Kanafi等人[18]又做了深入研究，他们通过对糖尿病小鼠皮下移植SHED的球囊，移植后90%小鼠血糖恢复到正常水平。去除SHED球囊，经组织病理学检查证实没有引起血糖升高，表明内源性胰岛再生成功。

SHED与肌萎缩：Kerkis等人[19]在研究进行性假肥大性肌营养不良狗的模型中发现注射了SHED狗的肌细胞内检测到了抗肌萎缩蛋白，这表明SHED对治疗肌营养不良有一定效果。基于此结果Greyson等人[20]进一步验证了SHED在治疗抗肌萎缩蛋白缺失的小鼠(DMD)作用，他们通过中医针灸理论在DMD小鼠膀胱上选取4个穴位，在4个穴位中注射SHED培养液并同时结合针灸治疗，组织学和免疫组化分析发现治疗组小鼠肌肉力量明显改善，同时体内肌酐磷酸激酶水平降低，此外在胫骨前肌观察中发现抗肌萎缩蛋白增加，再次证明了SHED治疗肌萎缩功效，但其具体机制不清。

SHED促进伤口愈合和延缓光老化：Nishino[21]在裸鼠背部伤口愈合时发现，SHED组通过增加胶原蛋白的生产使创面愈合速度加快，当在碱性成纤维细胞生长因子的存在下，SHED能更加有效的促进伤口愈合。Uedam等[22]在对紫外线光照引起裸鼠皮肤老化的模型中通过皮下注射SHED，发现能改善因辐射引起的皮肤细小皱纹，增加真皮厚度。

3 乳牙牙髓干细胞研究目前面临的困境

乳牙牙髓干细胞虽然有多种优势，但也存在一定的局限性。以上实验研究主要局限在动物模型上，其广泛的临床应用尚待检验。而且乳牙牙髓干细胞的增殖能力有限，他们经过有限的体外培养后趋于衰老，只有相对少量的自体SHED可从每个乳牙中分离，常常需要广泛的进行体外扩增使这些细胞获得移植和组织工程所需的细胞数量。此外，体外培养诱导分化成所需的细胞是治疗关键的一步，但在基因重编改造方面尚缺乏相关安全的病毒载体，以至于表达不正常细胞标志物，如OCT4，SOX2和MYC。低温冷冻乳牙牙髓干细胞也存在着牙髓分离率和增殖率降低的问题，Hyo-Seol Lee等[23]研究显示，冷冻保存3个月的乳牙与新鲜的牙齿相比牙髓分离成功率为70%，然而，冷冻3～9月导致成功率仅40%。这表明，增加冷冻保存期减少了牙髓的分离成功率。Lindemann等人[6]还发现随着保存时间延长，SHED的培养及增殖率也随之降低，并出现细胞的死亡或凋亡。

4 展 望

乳牙牙髓干细胞因为具有较强的增殖能力和多向分化潜能，大量临床前动物模型实验已证明，SHED在治疗包括神经脊髓损伤、骨缺损、成牙本质、伤口愈合、肌肉萎缩等疾病中具有显著疗效。2015年7月，我国首家GMP级乳牙干细胞库在“世界口腔干细胞之父”施松涛教授努力下落户北京，标志着我国在研究乳牙干细胞迈入新的一步。乳牙干细胞库的建立为更好的保存和应用SHED提供了基础。随着实验技术方法的不断进步、完善，将乳牙牙髓干细胞应用于临床将会极大地促进口腔医学乃至人类发展进步。

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山东省医药卫生科技发展计划项目(2015WS0108)。

陈文峰(1990—)，男，本科，主要从事口腔医学研究。

石运芝，E-mail: yzshi@tsmc.edu.cn。

R78

A

1004-7115(2017)01-0117-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.01.046

2016-06-10)