采用基因编辑和RNA 干扰技术抑制HBV 复制获进展

●本刊记者/

乙型病毒性肝炎（viral hepatitis type B，简称乙肝）是由乙肝病毒（HBV）引起的，具有传染性，主要临床表现为：乏力、食欲减退、恶心、呕吐、肝大及肝功能异常等。根据症状体征，乙肝又分为急性乙肝、慢性乙肝、重型乙肝等。我国有大约7800 万慢性乙肝感染者，其中慢性乙肝患者约2800 万人。目前，临床上用于治疗慢性乙肝的常用药物为核苷（酸）类似物和长效干扰素，二者均不能直接作用于HBV 的复制模板——共价闭合环状DNA（cccDNA），难以有效清除病毒实现临床治愈。因此，研发直接靶向cccDNA 的药物，寻找清除cccDNA的新方法和新策略是当前研发治疗慢性乙肝药物的热点。日前，北京大学医学部基础医学院鲁凤民教授课题组与许中伟、夏宁邵教授等合作，在《Theranostics》杂志上在线发表了研究论文,探索HBV病毒清除的新路径。王杰、陈然和张瑞阳为该论文的共同第一作者。

慢性乙肝难以实现临床治愈

慢性乙肝的传播途径为血液传播、母婴传播、性传播、皮肤黏膜破损传播等。感染慢性乙肝的患者乙肝病毒检测为阳性，病程超过半年或发病日期不明确。治疗慢性乙肝的总体目标是最大限度地长期抑制HBV，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延缓和减少肝脏失代偿、肝硬化、肝癌及其并发症的发生，从而改善患者生活质量，延长存活时间。

HBV 的复制模板cccDNA 半衰期较长，再加上cccDNA 池的不断补充，使细胞核内的cccDNA 持续存在，感染慢性化。目前，临床上用来治疗慢性乙肝的药物主要为干扰素（分为普通干扰素和长效干扰素）和核苷（酸）类似物，二者的治疗效果较好，但均不能直接作用于cccDNA，难以有效清除病毒实现临床治愈。因此，研发直接靶向cccDNA 的药物，寻找清除cccDNA 的新方法和新策略势在必行。

采用基因编辑和RNA 干扰技术抑制HBV 复制

近日，北京大学医学部基础医学院鲁凤民教授课题组与许中伟、夏宁邵教授等合作，通过模拟microRNA（miRNA）的生成过程，整合双gRNA 导向的CRISPR/Cas9 和RNA 干扰技术，高效破坏cccDNA，为探索直接靶向cccDNA的药物提供了新思路。

该研究以miRNA-31 为基本骨架，通过模拟其核心序列的二级结构设计HBV特 异 的miRNA——miR-HBV，miRNA两侧侧翼序列为特异性靶向cccDNA 不同位点的引导RNA——gRNA。该gRNA-(miR-HBV)-gRNA 三联体表达体系导入细胞后，在细胞核内转录形成gRNA-(miR-HBV)-gRNA 长 转 录 本，经 内 源的Drosha/DGCR8 复合体剪切，形成2个gRNA 和1 个miR-HBV 前 体premiR-HBV。进 入 细 胞 质 后，pre-miRHBV 进一步经Dicer 酶剪切，形成成熟的miR-HBV。一 方 面，双gRNA 导向的CRISPR/Cas9 系统通过切割并去除cccDNA 的关键调控和编码序列直接破坏cccDNA；另一方面，通过miRHBV 在转录后水平抑制HBV 复制，进而抑制cccDNA 池的补充，协同促进HBV cccDNA 的清除。此外，研究还发现，当pri-miRNA-31 的侧翼序列长度为38bp时，与双gRNA 组成的三联体对HBV 复制的抑制效率最高。

应用于临床仍需突破技术难点

此项技术虽然在实验阶段取得突破，但离临床应用尚有较远的距离。一方面，如何高效和靶向性地将三联体递送到受HBV 感染的肝细胞内是需要攻克的一大障碍；另一方面，CRISPR/Cas9 基因编辑技术的脱靶效应也具有安全隐患。近年来，随着Cas 核酸酶的不断改造，其脱靶效应已经得到了有效控制，安全性大大提高。而且，随着金黄色葡萄球菌Cas9 的 发 现，使 得CRISPR/Cas9 系 统可以装入腺相关病毒载体中，致使该技术应用于临床的距离逐渐缩短。

此次研究通过gRNA-(miR-HBV)-gRNA 三联表达框架联合CRISPR/Cas9和RNA 干扰技术高效破坏cccDNA，促进HBV 的清除，为慢性乙肝的抗病毒治疗提供了新的思路。此项研究得到了国家十二五重大科技专项计划“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”项目和国家自然科学基金的支持。