β-内酰胺类联合氟喹诺酮类抗菌药物治疗铜绿假单胞菌感染机制研究进展

徐 辉，何晓静，李晓冰，菅凌燕

·综述·

β-内酰胺类联合氟喹诺酮类抗菌药物治疗铜绿假单胞菌感染机制研究进展

徐 辉，何晓静，李晓冰，菅凌燕*

铜绿假单胞菌是一种革兰阴性菌，是医院感染的主要致病菌之一，具有致病力强、病死率高等特点。由于近年来抗菌药物的广泛使用，致使铜绿假单胞菌临床耐药率大幅度增长，多重耐药铜绿假单胞菌所造成的感染已成为临床治疗的热点和难点。本文对β-内酰胺类联合氟喹诺酮类抗菌药物治疗铜绿假单胞菌感染的机制进行综述。

铜绿假单胞菌；多重耐药；β-内酰胺类；氟喹诺酮类；联合治疗

0 引言

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是常见的条件致病菌，易引发呼吸系统及泌尿系统感染、败血症等疾病，对某些常见抗菌药物具有敏感性。近年来，由于耐药菌株的不断产生，使PA感染的治疗难度不断增加。目前，虽然国内外对抗菌药物联合治疗细菌感染观点存在差异，但联合用药治疗PA感染已经成为一种重要手段[1]。根据2014年铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识，β-内酰胺类与氟喹诺酮类抗菌药物联合应用已经成为临床治疗PA下呼吸道感染的一种常见用药方式[2]。本文针对近年来国内外β-内酰胺类与氟喹诺酮类抗菌药物对PA耐药机制的研究成果进行对比综述，对两种药物联合应用的可行性进行分析，为临床用药提供借鉴。

1 流行病学调查

据2009-2013年“中国CHINET细菌耐药性监测”调查显示[3-7]，在国内不同地区教学医院所分离出的临床分离菌株中，PA分离率居所有革兰阴性菌分离率的第3～4位；根据连续监测数据显示，PA对亚胺培南、头孢他啶的年度耐药率分别接近30%和20%，PA对环丙沙星、左氧氟沙星的年度耐药率约为20%，泛耐药PA菌株检出率已达2.0%，抗PA治疗的前景不容乐观。有研究显示，在国内某医院收集的259例医院获得性肺炎(Hospital-acquired pneumonia，HAP)患者的痰液标本中，PA分离率高达22.0%，居所有分离菌株的首位，PA所造成的呼吸系统感染已经成为临床上最常见的细菌感染之一[2,8]。

2 主要耐药机制研究进展

2.1 产酶对β-内酰胺类抗菌作用的影响 β-内酰胺类抗菌药物主要通过抑制PA的D-丙氨酰-D-丙氨酸转肽酶，进而影响其细胞壁的正常合成而导致细菌死亡。β-内酰胺酶的产生是PA对β-内酰胺类抗菌药物耐药的最主要方式，主要包括头孢菌素酶(Ampler class C β-lactamase，AmpC)、超广谱β-内酰胺酶(Extend spectrum β-lactamases，ESBLs)和金属β-内酰胺酶(Metallo-β-lactamases，MBLs)等。

Amp C酶主要以头孢菌素为底物，并且克拉维酸等β-内酰胺酶抑制剂对其无抑制作用，可水解大部分抗PA β-内酰胺类药物。大多数PA菌株天然存在Amp C基因，通常只表达少量Amp C酶。细胞壁代谢所产生的N-乙酰葡糖胺-N-乙酰胞壁酰三肽(G-aMT)，可通过两种代谢途径被调控蛋白Amp D分解为两种代谢产物N-乙酞胞壁酰三肽(aMT)和乙酰胞壁酰五肽(UDP-aMP)。1997年，Jacobs[9]在对细胞壁与耐药关系的研究中发现，当β-内酰胺类抗菌药物存在时，部分细菌的细胞壁代谢底物aMT将在胞内大量积累并替代UDP-aMP，将转录调控因子Amp R激活，从而诱导Amp C酶高表达，形成产Amp C酶的耐药菌株。

目前，在临床分离的各类型革兰阴性杆菌中，国内外学者已发现200余种ESBLs，在PA中已发现了8个群属的ESBLs，其可通过质粒介导的方式导致多种细菌对β-内酰胺类抗菌药物产生耐药，多见于大肠埃希菌等肠杆菌属[10]。PA中存在的ESBLs，主要以TEM、OXA、VEB、PER、CTX-M等群属最为常见。因抗菌药物使用特点的区别，各国家和地区ESBLs类型在不同细菌中具有较大的差异。对PA产生的ESBLs进行流行病学分析的结果显示，巴西以CTX-M群属最为常见，而在我国温州地区的PA感染患者体液中收集到的460株PA中，54株PA携带TEM型ESBLs，占11.8%，CTX-M仅占总数的1.95 %[11-12]。

MBLs作为最广谱的β-内酰胺酶，可水解除氨曲南外所有的β-内酰胺类抗菌药物。MBLs主要包括IMP、SIM、VIM等类型，其中在亚洲地区多以IMP型和VIM型最为常见。大多数的MBLs位于耐药细菌的Ⅰ类整合子中，常与其他耐药基因共存，极易发生水平传播。2007年，王杰等[13]从我国16个城市28家医院收集的645株PA菌株中，检测出22株MBLs阳性PA菌株，包括1株IMP-1型，13株IMP-9型，8株VIM-2型。MBLs高水平检出率已成为导致PA对β-内酰胺类耐药的重要因素之一。

2.2 靶位改变对氟喹诺酮类抗菌作用的影响 氟喹诺酮类抗菌药物通过抑制细菌的DNA回旋酶和拓扑异构酶Ⅳ，从而抑制DNA合成，产生杀菌作用。DNA回旋酶是由两个gyrA亚基和两个gyrB亚基组成的四聚体，拓扑异构酶Ⅳ是两个parC亚基和两个parE亚基组成的四聚体，而其中的任意一个亚基突变都会导致细菌对氟喹诺酮类药物的耐药。

近年来，质粒介导的氟喹诺酮类药物耐药机制(Plasmid-mediated quinolones resistance，PMQR)已逐渐成为氟喹诺酮类抗菌药物耐药的重要机制之一；目前的研究已发现多种PMQR机制，分别为qnr、aac(6′)-Ib-cr、qepA及oqxAB基因编码，携带耐药基因质粒的菌株间传播已经成为喹诺酮类耐药的重要原因之一[14]。质粒所携带qnr、aac(6′)-Ib-cr等基因在一定程度上导致PA的MIC升高，使细菌对药物的敏感性降低。Yang等[15-17]研究发现，在对氟喹诺酮类药物高水平耐药的菌株中，携带qnr基因的菌株较少，其原因可能是qnr基因可与DNA回旋酶和拓扑异构酶Ⅳ最易发生突变的喹诺酮抗性决定区域(Quinolone resistance determining region，QRDR)相结合，对QRDR产生保护作用，使携带qnr的菌株选择压力小于不携带qnr的菌株。

3 β-内酰胺类与氟喹诺酮类联合治疗铜绿假单胞菌感染可行性研究进展

2014年铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识指出，多个临床研究的Meta分析结果显示：与单独用药治疗PA感染相比，联合用药组患者病死率降低10%～20%；并且，将β-内酰胺类与氟喹诺酮类药物联用，可分别提高对PA的抗菌活性[2]。Zhao等[18]研究发现，在最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)之上还存在防突变浓度(Mutant prevention concentration，MPC)，血药浓度低于MIC时，由于无选择压力，耐药突变菌株不会富集产生，当血药浓度高于MPC时，细菌需至少发生两种耐药突变才可正常生长，而自然状况下细菌发生多次突变频率非常低，耐药菌株不会大量产生；MIC和MPC之间的浓度范围称为突变选择窗(Mutant selection window，MSW)，当血药浓度位于MSW时，耐药突变菌株将选择性富集扩增，导致细菌耐药。抗菌药物联合使用时，由于两类抗菌药物的耐药机制不同，单次突变菌群很难选择性富集，致使MPC显著降低、MSW缩小，能有效控制耐药菌株的产生。对比美罗培南单药治疗PA感染和美罗培南分别与环丙沙星、左氧氟沙星联合治疗PA感染的药敏结果显示，美罗培南的突变选择指数(Selection index，SI)由32分别降为2和4，抗菌药物联合使用后，美罗培南耐药菌株出现频率降低；Zhanel等[19-21]将β-内酰胺类与氟喹诺酮类抗菌药物联合使用，突变选择指数同样有不同程度的降低。

根据对PA基因组序列分析，介导PA产生耐药的外排泵主要包括4种RND外排系统，分别为MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN、MexXY-OprM，其结构包括内膜转运蛋白、质膜融合蛋白和外膜通道蛋白[22]。四种RND外排泵亚型对喹诺酮类的转运能力有显著差异；不含氟的喹诺酮类抗菌药(如哌啶酸、吡咯酸等)对MexEF-OprN最为敏感；左氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星等含氟原子的喹诺酮类药物对MexCD-OprJ和MexEF-OprN较敏感，MexAB-OprM及 MexXY-OprM次之[23-25]。原因是氟喹诺酮类药物中具有极性大、电负性强的氟原子，对携带正电荷的MexCD-OprJ等外排泵产生较强的电荷效应，导致亲和力强。

在对β-内酰胺类药物的研究中，大部分青霉素类、头孢菌素类以及碳青霉烯类(除亚胺培南)药物均可被内膜蛋白MexB识别；相比之下，MexD作用范围较小，主要以羧苄青霉素、磺苄西林和头孢他啶等药物作为底物[24,26]。机制可能是具有赖氨酸残基的MexD通过电荷作用对以负电荷存在的羧苄青霉素、磺苄西林等更有亲和力。Sacha等[27]研究表明，MexAB-OprM过表达可明显提高美罗培南的MIC，却几乎不影响PA对亚胺培南的敏感度。原因是美罗培南具有多个疏水末端与刚性侧链，空间结构较大，导致美罗培南对内膜蛋白MexB远端连接口袋敏感性强；而亚胺培南具有体积小、疏水性弱等特点，使其对MexAB-OprM敏感性较低。通过对比上述报道，β-内酰胺类与氟喹诺酮类药物的主要外排系统具有差异，单一外排通道被激活不能同时使两类药物大量外排，两类药物联合应用，可防止外排通道单次突变导致的耐药菌株富集扩增。

OprD2孔道是亚胺培南进入PA的特异性通道，Lee等[28]对OprD基因测序结果显示，OprD基因突变主要是1 bp插入、基因缺失及核苷酸突变形成终止密码子，可导致OprD2孔道缺失致使PA对亚胺培南产生耐药。OprD基因突变对其他碳青霉烯类药物影响较小，只会增加美罗培南的MIC；如出现对二者同时耐药，往往合并其他耐药机制，如AmpC酶的大量产生[29]。Livermore[30]同时证明，单一OprD基因突变导致OprD蛋白减少或缺失仅导致PA对亚胺培南耐药；当与MexCD-OprJ过度表达等氟喹诺酮耐药机制并存时，PA才同时对喹诺酮类产生耐药。

以上研究表明，氟喹诺酮类与β-内酰胺类联合应用可避免单一突变导致的PA耐药，同时具有更好的治疗效果。值得注意的是，相对于耐药菌株的不断涌现，新型抗菌药物的开发与研制进度显得缓慢。正确选择与应用抗菌药，降低细菌选择压力，从而减少耐药菌株的产生已成为今后治疗细菌感染的重点。同时，对于单一药物治疗效果差的细菌，如多重耐药PA等所造成的感染，不应盲目联合用药，仍需以药敏试验、较为成熟的科研理论所得出结果作为选择最佳治疗方案的指导，更好地控制耐药菌株的产生及获得更优的治疗效果。

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Research progress on the mechanism of beta lactam combined with fluoroquinolones in the treatment of infection ofPseudomonasaeruginosa

XU Hui,HE Xiao-jing,LI Xiao-bing,JIAN Ling-yan*

(Department of Pharmacy,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Pseudomonasaeruginosaas a Gram-negative bacteria,is the main pathogenic bacteria of nosocomial infection with the characteristics of strong pathogenicity and high fatality rate.Due to the wide use of antibacterial agents in recent years,the resistance rate toPseudomonasaeruginosahas increased significantly.The infection caused by multiple drug-resistantPseudomonasaeruginosahas evolved into a hot and difficult point in clinical treatment. This paper reviews the mechanism of beta lactam combined with fluoroquinolones in the treatment of infection ofPseudomonasaeruginos.

Pseudomonasaeruginosa;Multi-drug resistance;Beta-lactams;Fluoroquinolones;Combination therapy

2017-01-16

中国医科大学附属盛京医院，沈阳 110004

辽宁省自然科学基金项目(2014021090)

10.14053/j.cnki.ppcr.201706027

*通信作者