诱导多能干细胞应用研究进展

孙传河，高鹏琳，廖伟龙，姜文斐，潘卫东

上海中医药大学附属曙光医院脑病科，上海 201203

综述

诱导多能干细胞应用研究进展

孙传河，高鹏琳，廖伟龙，姜文斐，潘卫东

上海中医药大学附属曙光医院脑病科，上海 201203

利用体细胞重编程技术将已分化的体细胞转化为诱导多能干（induced pluripotent stem，iPS）细胞是生命科学领域的一个里程碑事件。iPS细胞与胚胎干细胞的作用类似，均有分化成机体各种成熟细胞的潜能，但前者可以避免胚胎干细胞研究中存在的免疫排斥和医学伦理等问题。因此，iPS细胞在基础及临床研究领域均展现出良好的应用前景。本文对iPS细胞历经10年的研究历程、iPS细胞目前在临床各类疾病及药物监测中的应用以及iPS细胞研究中存在的问题进行综述，重点阐述iPS细胞在神经系统疾病中的应用。

诱导多能干细胞；神经系统疾病；心血管系统疾病；视网膜病变；传染病；药物监测

潘卫东

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PAN Weidong

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panwd_IMI@163.com

2006年，日本Takahashi等[1]首次利用特定的转录因子将小鼠成纤维细胞重编程为诱导多能干（induced pluripotent stem，iPS）细胞，这一研究掀起了一场医学变革。10年后的今天，iPS细胞在生物研究领域的影响逐渐凸显出来。

1 iPS细胞研究的发展历程

2006年8月，日本Takahashi等[1]首次诱导出小鼠iPS细胞，此细胞具备分化成表皮细胞、神经细胞、肌纤维细胞等多种类型细胞的能力。2007年，Takahashi等[2]进一步简化了上述诱导过程，将24个转录因子缩减至4个转录因子，成功诱导出人体iPS细胞；同年，Yu等[3]筛选出另一组转录因子。2008年，Liao等[4]利用患者的体细胞诱导出致病的iPS细胞。2009年，诱导干细胞的效率得到提升，并且转录因子基因既可以被成功导入，又可以被成功移除[5]；同年，利用iPS细胞成功诱导出多巴胺神经元[6]。2012年，John Gurdon和Shinya Yamanaka因发现成熟细胞可被重新编辑而被授予诺贝尔生理学或医学奖。2013年，Maeda等[7]将2例老年黄斑变性患者的表皮细胞诱导成iPS细胞，随后将iPS细胞成功转化成视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）。2014年，日本理化学研究所开展了自体人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）来源的RPE移植治疗年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）的临床试验[8]。

2 iPS细胞的应用

2007年，小鼠镰状红细胞贫血症通过iPS细胞得以成功治愈[9]。2008年，肌萎缩侧索硬化症患者的皮肤细胞首次被诱导成iPS细胞且分化为运动神经元[10]。2009年，利用iPS细胞诱导出的内皮细胞和内皮前体细胞成功治疗了血友病A小鼠，这给单基因遗传病的治疗带来了希望[11]。起初，在iPS细胞诱导为成熟细胞的过程中，一般会有病毒DNA的参与，而Lu等[12]则避免了这一局限，为iPS细胞在人类中的应用奠定了基础。

2.1 iPS细胞在神经系统疾病中的应用

2008年，利用iPS细胞成功诱导出神经胶质细胞和神经元[13]，这为神经退行性病变的治疗带来了希望；同时，该方法也将取代以往神经系统疾病发病机制研究常用的动物转基因或基因敲除模型，利用人体iPS细胞模型来研究神经系统疾病，如此可以动态地全面观察疾病过程中分子和细胞水平的变化，避免以往动物模型研究存在的鼠类及其他啮齿类动物与人类种属之间存在差异的局限。换言之，人体iPS细胞模型是研究人体发育过程的最佳体外模型。

2.1.1 多发性硬化

李梅等[14]认为，iPS细胞在多发性硬化治疗中具有广泛的应用前景。利用Takahashi等[1-2]的方法，将iPS细胞来源的神经干细胞和少突胶质前体细胞重新编程后移植入实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠模型以及其他脱髓鞘动物模型后，发现可以通过分泌神经营养因子如白血病抑制因子等，促进内源性髓鞘细胞分化，使动物的残疾状态得以改善，并观察到髓鞘再生。此外，iPS细胞调控的营养作用可维护血脑屏障的完整性，使炎性反应局限于中枢神经系统。抑制中枢神经系统炎性反应可以减轻髓鞘的受损。iPS细胞还可最终分化成少突胶质细胞，促进髓鞘形成及修复，从而对实验性变态反应性脑脊髓炎及其他脱髓鞘疾病具有治疗作用。

2.1.2 帕金森病

帕金森病是以中脑多巴胺神经元调亡为特征的神经退行性病变，一旦发病，不可逆转。目前临床上常用的治疗手段仅是改善症状，而无法延缓病情的进展。随着医学技术的发展，细胞移植为帕金森病的治疗带来了新的希望。通过干细胞技术诱导出正常的多巴胺神经元，并将其导入中枢神经系统，有望彻底治愈帕金森病。有学者报道，将多巴胺神经元植入帕金森病患者脑中，可使其运动症状得到一定程度的改善[15]；但鉴于获取正常多巴胺神经元需要破坏胚胎，而这种行为违背了医学伦理学的原则，因此导致细胞移植的发展受到了限制。iPS细胞的出现可望成功解决这一难题。2010年，利用帕金森病患者的iPS细胞，成功诱导出多巴胺神经元[16]；将诱导成功的多巴胺神经元移植入大鼠模型后，能够改变大鼠的运动功能[17]。此后，有学者开始利用帕金森病患者的iPS细胞对多巴胺神经元的死亡机制进行研究，结果发现线粒体功能受损是神经元死亡的关键环节。此外，基因突变导致多巴胺神经元易于发生氧化损伤的原因是突变的基因可导致多巴胺神经元的脆性增加[18-19]。

2.1.3 阿尔茨海默病

阿尔茨海默病是一种以进行性认知和记忆障碍为主要临床表现的中枢退行性疾病，严重时可出现精神行为异常，给患者及其家属和社会均带来巨大的负担。阿尔茨海默病一旦发生，将呈进行性加重，且无法逆转，目前尚缺乏满意的治疗方法。因此，研究阿尔茨海默病的发病机制以及有效的防治手段迫在眉睫。既往研究的结果显示，阿尔茨海默病的发生主要与β淀粉样肽大量沉积导致神经元毒性、Tau蛋白的神经毒性导致神经损伤以及神经纤维缠结等有关[20-21]。特别是β淀粉样肽的聚集，可导致神经元发生退行性病变。此外，基因突变也是引发阿尔茨海默病的重要因素。目前已能够获得基因突变的iPS细胞[22]，将其进一步分化成神经元细胞后，发现存在β淀粉样肽的大量聚集，由此提示β淀粉样肽可导致阿尔茨海默病的发生。

2.1.4 Huntington病

Huntington病是由Huntington基因中的三核苷酸重复序列（CAG）重复扩增产生具有细胞毒性的Huntington蛋白所致。一般认为，三核苷酸重复序列（CAG）超过35个才会发病。Huntington病在临床上主要表现为舞蹈样动作和进行性认知障碍。有学者利用Huntington病患者的iPS细胞对三核苷酸重复序列（CAG）重复扩增的长度进行研究，结果发现与正常人体iPS细胞相比，Huntington病患者的iPS细胞在神经发育、RNA代谢和蛋白稳态等方面均存在差异，并且三核苷酸重复序列（CAG）重复扩增长度较短的细胞的基因和蛋白表达均更易受到干扰，而重复扩增长度最长的细胞对细胞刺激物的反应最弱，由此提示Huntington病与重复扩增长度有关[23]。近年来的不少研究都观察到Huntington病患者存在转录抑制因子活性的改变，其iPS细胞中的溶酶体活性发生改变，这为Huntington病的病理机制以及治疗研究提供了新的线索[24-25]。

2.2 iPS细胞在心血管系统疾病中的应用

Nelson等[26]观察发现，利用iPS细胞诱导成的心脏实质细胞具有正常心肌细胞的恢复性收缩和电位稳定等特性；同时，iPS细胞作为自体细胞，可以更好地修补心脏细胞。近年来的研究[27]证实，在iPS细胞的诱导分化过程中，可以顺利转化出可扩展的心脏祖细胞，该细胞可以进行自我更新，且适合低温贮藏，还能够继续分化并培育出低度异质性的其他细胞，由此意味着可显著缩减实验时间和经费。Lalit等[28]发现了5种特异性转录因子，能够将小鼠成纤维细胞诱导为心脏祖细胞，后者在催化剂和白细胞抑制因子的作用下，可以不断扩增。Zhang等[29]的研究也发现，在酪氨酸激酶JAK抑制剂3、骨形态生成蛋白4、激活素、CHIR99021和SU5402的参与下，特异性转录因子可将小鼠成纤维细胞转化为诱导的可扩展心脏祖细胞；在骨形态生成蛋白4的作用下，该细胞能够不断扩增，并且分化成心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。Cao等[30]的研究发现，在复合细胞因子的作用下，通过人多能干细胞（human pluripotent stem cells， hPSCs） 可获得同种的心血管祖细胞，后者可以自我更新，并不断扩增。能够获得可扩增祖细胞的其他方法包括将可发挥作用的基因进行转换，使其具有永久性。Birket等[31]等将Dox-inducible Myc表达片段导入hiPSCs，可使心脏祖细胞成倍扩增。类似的方法曾被报道用于血小板或红细胞的增殖研究[32-33]。总之，来自iPS细胞的可扩展细胞不但可以定向分化，且分化效率亦不断提高。因此，心肌梗死等心血管疾病实现完全自我修复是值得期待的。

2.3 iPS细胞在视网膜病变中的应用

2009年已提出通过诱导iPS细胞来治疗视网膜变性疾病[34]；此后，利用iPS细胞可成功诱导出视网膜前驱细胞，将其移植入视网膜变性小鼠体内，可诱导出具有正常视网膜生理特点的视网膜类型的细胞。2013年，Maeda等[7]利用2例老年黄斑变性患者的表皮细胞诱导成iPS细胞，随后将iPS细胞成功转化成RPE。此后不久，日本的研究人员开始研发其他的诱导方法，即刺激激发获得多能状态（stimulus-triggered acquisition of pluripotency，STAP），这一方法对Takahashi等［1-2］的理论造成了一定的冲击。

2.4 iPS细胞在感染性疾病中的应用

iPS细胞可以模拟人类胚胎发育过程，所以可被用于诊断孕妇是否感染Zika病毒以及该病毒是如何导致婴儿小头畸形的。Qian等[35]利用iPS细胞塑造出类脑器官，当发生Zika病毒感染时，发现Zika病毒首先侵袭神经干细胞而不是新生的神经元，继而导致大量神经干细胞的死亡以及大脑皮质神经元细胞的减少，最终导致小头畸形。

2.5 iPS细胞在药物监测中的应用

iPS细胞已被成功应用于药物监测，利用iPS细胞能够鉴定出适用于疾病的药物。2016年，研究人员从患有遗传性痛觉障碍的患者体内获取iPS细胞，进而诱导出感觉神经元；结果发现，钠通道阻滞剂可以降低感觉神经元的兴奋性，从而减轻疼痛[36]。由此可见，iPS细胞可用于测试患者对药物的敏感性，但尚需得到更多证据的支持。

2.6 iPS细胞的其他应用

一些研究团队还发现，iPS细胞不仅可以被塑造成人类器官，如肝和肠等，还有助于揭示疾病的发病机制。例如，利用iPS细胞可以演示与青光眼发病相关的基因复制与神经细胞丛凋亡的关联[37]，以及从基因和细胞更新的角度阐释Huntington病的发病机制[23]。

3 iPS应用中存在的问题

iPS细胞研究已经过了漫长而辉煌的10年发展历程。相较于胚胎干细胞，iPS细胞尽管避免了医学伦理学问题及免疫排斥，但仍存在一些问题值得深思，亟待解决。

首先，诱导iPS细胞的方法虽然几经改进[38-39]，但不少诱导方法的效率依然很低，仅有少量细胞能够完全诱导成功，并且诱导后的iPS细胞的状态并不稳定，致使其在实验过程中很难受到控制。Paquet等[40]在对1例阿尔兹海默病患者进行iPS细胞研究时即遇到这一难题，他们发现患者的iPS细胞在培养过程中不受控制，推测这可能与基因表达有关，遂将目光转向基因修饰。近年来，精准的基因修饰方法已经得到了很好的应用，其中基因编辑技术CRISPR/Cas9是近年来被广泛应用的基因修饰工具。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，可以将疾病相关突变因子导入iPS细胞中，与未进行基因修饰的细胞相比显示出明显的优势。利用CRISPR技术可使iPS细胞发生特定的点突变，从而可以直接获得阿尔兹海默病突变细胞。

其次，由于iPS细胞仅是一种胚胎细胞类似物，所以在应用于一些迟发性疾病如痴呆的研究时，并不十分理想。研究人员正设法通过蛋白水平的修饰，使iPS细胞发育成熟，从而使其得到更好的应用。再者，尽管现在已有许多被诱导成功的细胞，但研究人员尚不清楚其中的具体过程。目前，主要通过监测基因表达水平以系统性地鉴别这些细胞的身份及安全性。

4 iPS应用的未来展望

一般而言，一项基础研究的成果能够被成功地应用于临床大约需要花费20年的时间。iPS细胞的应用同样也将经历一个漫长的过程。2016年3月，欧洲iPS细胞银行启动了利用iPS细胞构建人类疾病细胞模型的计划，Shinya Yamanaka亦参与其中，目标是获取多种具有免疫兼容性的iPS细胞。在iPS细胞相关的细胞治疗领域，未来面临的最大挑战不是来自于技术，而是需要获得政府部门和药物生产厂商的大力支持。此外，在药物监测和疾病模型构建方面，iPS细胞仅能简化这一过程。

总之，任何一项新技术的应用都将经历一个漫长的过程，iPS细胞技术也不例外。

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Progress in application of induced pluripotent stem cells

SUN Chuanhe, GAO Penglin, LIAO Weilong, JIANG Wenfei, PAN Weidong
Department of Neurology, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

Induced pluripotent stem (iPS) cells can be directly generated from differentiated somatic cells by transduction, which is a great revolution in life sciences. iPS cells are similar to embryonic stem cells and have the potential to differentiate into mature cells, but the former can avoid immunological rejection and medical ethics which exists in the study of embryonic stem cells. Therefore, iPS cells have shown a good prospect in the field of basic and clinical research. This paper reviews the 10-year development course of iPS cells research, the use of iPS cells in many kinds of diseases and clinical drug monitoring, and the problems in the study, especially focusing on the application of iPS cells in nervous system diseases.

Induced pluripotent stem cells; Nervous system diseases; Cardiovascular system diseases;Retinopathy; Communicable diseases; Drug monitoring

March 30, 2017; accepted for publication June 7, 2017

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10.12022/jnnr.2017-0014

国家自然科学基金面上项目（编号：81373619）

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CONFLICT OF INTEREST: The authors have no con fl icts of interest to disclose.

孙传河, 高鹏琳, 廖伟龙, 等. 诱导多能干细胞应用研究进展[J]. 神经病学与神经康复学杂志, 2017, 13(2):74-79.

To cite: SUN CH, GAO PL, LIAO WL, et al. Progress in application of induced pluripotent stem cells. J Neurol and Neurorehabil, 2017,13(2):74-79