槐定碱通过Caspase-3介导的人胰腺癌细胞株capan-1凋亡机制研究

任丽平，李先佳，金少举

·基础医学·

槐定碱通过Caspase-3介导的人胰腺癌细胞株capan-1凋亡机制研究

任丽平1，李先佳2，金少举1

目的 探讨槐定碱对人胰腺癌细胞株capan-1凋亡及Caspase-3信号通路的影响。方法 CCK-8检测槐定碱对capan-1细胞活力的影响，Hoechest 33342染色法观察细胞凋亡，分光光度法检测Caspase-3的活性。结果与对照组比较，槐定碱能明显抑制capan-1细胞生长(P<0.05)，促进capan-1细胞凋亡(P<0.05)，上调Caspase-3的活性(P<0.05)。结论 槐定碱抑制capan-1细胞增殖，促进细胞凋亡与下调Caspase-3的活性相关。

胰腺癌；capan-1；槐定碱；Caspase-3

槐定碱(sophoridine,SR)为中药苦豆子(sophora alopecuroides)中有效活性成分之一[1]，对绒癌、恶性葡萄胎等恶性滋养细胞肿瘤具有较好的抑制作用[2]。研究证实Caspase-3信号通路在多种肿瘤的发生和发展中扮演着重要的角色[3]。本实验采用槐定碱对人胰腺癌细胞株capan-1诱导凋亡作用，通过分析Caspase-3活性及采用其抑制剂后细胞凋亡的变化，探讨其具体作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器 槐定碱(宁夏盐池县医药公司提供，批号：060630，纯度>99%)。胎牛血清(杭州四季青生物技术公司，批号：140130)；CCK-8细胞活力检测试剂盒(日本Dojindo)；DMEM培养基(Dulbeco′s modified eagle medium,DMEM)(美国Hyclone公司，批号：NAE1396)；Hoechst33342 荧光染料(碧云天生物技术有限公司，批号：1022)；Caspase-3活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20140312)；Ac-DEVD-CHO(南京凯基生物公司，批号：20140914)；TE2000型倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)；ST-360酶标仪(上海科华实验系统有限公司)。

1.2 方法 capan-1细胞株由漯河医专分子生物学实验室传代保种，用含10%胎牛血清的 DMEM培养基在37 ℃、5% CO2条件下培养，用 0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(eathylene diamine tetraacetic acid，EDTA)消化。槐定碱采用DMEM溶解至20 g·L-1，保存于-20 ℃ ，备用。

1.2.1 细胞活力检测 取对数期密度为1×104个·mL-1capan-1细胞悬液100 μL接种于96孔板，贴壁后24 h同步化，弃上清。参考前期[4]研究选择设立SR2.5 g·L-1组、SR5 g·L-1组、抑制剂+SR5 g·L-1组(简称抑制组)及对照组，对照组加10%胎牛血清的DMEM的培养基，SR2.5 g·L-1组和SR 5 g·L-1组分别加浓度为2.5 g·L-1、5 g·L-1槐定碱且含10%胎牛血清的 DMEM培养基，抑制剂+SR 5 g·L-1组加含10%胎牛血清、5 g·L-1槐定碱及100 μmol·L-1的Ac-DEVD-CHO的DMEM的培养基，阴性对照组给予等量培养液，每组设置3个复孔，37 ℃、5% CO2条件下培养48 h，加入CCK-8 10 μL/孔孵育2 h，酶标仪于570 nm检查光密度值，计算细胞活力。

1.2.2 capan-1细胞凋亡观察 采用Hoechest 33342染色法，参照“1.2.1”法设置各组，37 ℃、5%CO2温箱培养48 h后，弃去上清，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)清洗3次，每孔加入Hoechest 33342染色液10 μL，4 ℃，避光染色5 min，倒置荧光显微镜下观察细胞凋亡形态变化，并计数凋亡细胞，计算凋亡率。

1.2.3 分光光度法检测Caspase-3活性 参照“1.2.1”法设置各组。细胞培养48 h后终止培养，0.05%胰酶消化并收集细胞，PBS洗涤1次，按照每200万细胞50 μL的比例加入裂解液，冰浴裂解30 min，4 ℃12 000 r·min-1离心15 min，取上清，0.05%胰酶消化收集细胞, Bradford法测定蛋白的量，取50 μL含150 μg蛋白的细胞裂解上清，加入50 μL 2×反应液和5 μL Ac-DEVD-pNA，37 ℃避光孵育4 h，酶标仪在波长400 nm检测测定吸光度值。

2 结果

2.1 细胞活性检测 与对照组比较，2.5 g·L-1、5 g·L-1槐定碱能明显降低capan-1细胞活力(P<0.05)。抑制组细胞活力明显高于SR5 g·L-1组(P<0.05)，见图1。

①与对照组比较，P<0.05，②与抑制组比较，P<0.05。图1 SR对capan-1活力的影响

2.2 capan-1细胞凋亡观察 图2显示，对照组细胞包膜完整，细胞核形态比较规则,细胞核和细胞质着色较深，发光均匀，呈现正常的蓝色。抑制组出现部分细胞破碎和少量的凋亡小体。SR组细胞核致密浓染，部分颜色发白，而SR5 g·L-1组部分细胞的细胞核碎裂，产生较多凋亡小体。

图2 capan-1细胞凋亡观察(Hoechet 33342, ×200)

2.3 细胞凋亡率和Caspase-3活性的比较 与对照组比较，抑制组细胞capan-1细胞凋亡率和Caspase-3活性明显升高，均有统计学差异(P<0.05)；与抑制组比较，SR2.5 g·L-1组、SR5 g·L-1组capan-1细胞凋亡率和Caspase-3活性明显高于抑制组，均有统计学差异(P<0.05)，见图3-4。

图3 细胞凋亡率的比较

①与对照组比较，P<0.05；②与抑制组比较，P<0.05。图4 Caspase-3活性的比较

3 讨论

胰腺癌为常见的恶性肿瘤，病死率较高，目前手术治疗为主，辅以放疗、化疗及中医疗法等多种方法，但治疗后的复发率和转移率依然没有得到有效控制。槐定碱是一种生物碱类活性成分，对癌细胞具有直接杀伤作用，且毒性较低[5]。本研究采用CCK-8法比较了槐定碱对胰腺癌细胞株capan-1活力的影响，结果表明，槐定碱有可能通过上调Caspase-3活性来抑制capan-1的活力，并促进了胰腺癌细胞株capan-1凋亡，产生碎片或变小。槐定碱与Caspase-3活力抑制剂联用时，槐定碱对capan-1的活力和凋亡的影响能力明显减弱，可能是由于抑制剂抑制capan-1细胞中Caspase-3信号通路，拮抗槐定碱通过线粒体路径诱导的细胞凋亡，同时降低capan-1的活力。

研究显示，胰腺癌的发生与细胞凋亡失衡有关，诱导细胞凋亡可以有效地治疗肿瘤[6]。本研究采用Hoechst33342染色显示，不同质量浓度的槐定碱作用后，部分细胞核发生碎裂，核染色质呈分叶、碎片状，提示槐定碱可能通过某种方式诱导并促进了胰腺癌细胞株capan-1凋亡。Caspase-3是Caspase家族重要成员之一，在多种刺激物诱导的凋亡中起到关键作用，为细胞凋亡的执行蛋白。一般而言，细胞在凋亡信号的刺激下，通过各种凋亡信号启动级联反应，其中proCasepase-3断裂产生具有活性的Cleaved Caspase-3，裂解多聚(ADP-核糖)聚合酶，同时诱发线粒体产生细胞色素C，并启动后续的线粒体凋亡。本研究结果显示，2.5 g·L-1、5 g·L-1槐定碱作用于capan-1细胞后，Caspase-3活性明显升高，细胞凋亡率明显增加，加入Caspase-3抑制剂后，capan-1细胞凋亡率明显降低，提示槐定碱通过Caspase-3途径诱导线粒体路径细胞凋亡。但在此过程中，槐定碱capan-1细胞线粒体功能的影响还有待进一步研究。

总之，槐定碱能通过调节Caspase-3信号通路中Caspase-3的表达水平，促进capan-1细胞凋亡，从而发挥较好的抗肿瘤效果。

[1] 许婷,严祥.苦豆子生物碱对消化系统炎性疾病的影响[J].国际消化病杂志,2015,53(1):52-54.

[2] 闫德祺,闫英男,阿力木·买买提,等.苦参活性成分的抗肿瘤作用机制研究进展[J].现代生物医学进展,2014,14(24):4776-4779.

[3] Carlisi D,D′Anneo A,Angileri L,et al.Parthenolide sensitizes hepatocellular carcinoma cells to TRAIL by inducing the expression of death receptors through inhibition of STAT3 activation[J].J Cell Physiol,2011,226(6):1632-1641.

[4] 任丽平,李先佳,金少举.槐定碱对人胰腺癌细胞株capan-1增殖及侵袭能力的影响[J].河南科技大学学报(医学版),2016,34(4):244-246.

[5] 严继贵,杨宇清,王雅洁,等.槐定碱抗骨癌痛作用及其机制研究[J].中国中药杂志,2013,59(23):4134-4137.

[6] 马佳,方斌斌,曾凡鹏,等.葡萄籽原花青素下调miR-27a表达抑制胰腺癌细胞生长[J].中南大学学报(医学版),2015,40(1):46-52.

Effect of Sophoridine on Apoptosis of Human Pancreatic Cancer Cell Line Capan-1 by Caspase-3 Signaling Pathway

REN Li-ping1, LI Xian-jia2, JIN Shao-ju1

(1.Department of Pharmacology,Luohe Medical College,Luohe 462002,China; 2.Department of Biochemistry,Luohe Medical College,Luohe 462002,China)

ObjectiveTo investigate the effects of sophoridine on apoptosis of human pancreatic cancer cell line capan-1 by Caspase-3 signaling pathway.MethodsCCK-8 was used to detect the effect of sophoridine on the viability of capan-1 cells. Apoptosis was observed by Hoechest 33342 staining. The expression of Caspase-3 was detected by spectrophotometry.ResultsCompared with the control group, sophoridine could significantly inhibit the growth of capan-1 cells(P<0.05), promote cell apoptosis(P<0.05), up-regulate the expression of Caspase-3(P<0.05).ConclusionSophoridine could inhibit the proliferation of capan-1 cells and promote cell apoptosis, which was related to the up-regulation of Caspase-3.

pancreatic cancer; capan-1; sophoridine; Caspase-3

1672-688X(2017)01-0001-03

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.01.001

2.河南省高等学校重点科研资助项目(16B310004)

2016-01-17

1.漯河医学高等专科学校药理教研室，河南漯河 462002 2.漯河医学高等专科学校生化教研室，河南漯河 462002

任丽平(1984—)，女，河南舞阳人，讲师，从事肿瘤药理学研究。

金少举，博士，副教授，E-mail：37050573@qq.com

R966;R735.9

A

1.河南省科技攻关计划(社会发展领域)(162102310596)

3.漯河医学高等专科学校2016年度校级研究资助计划 项目(2016-S-LMC-13)