非小细胞肺癌PKM2的表达及与放疗敏感性的关系分析

王伟星 杨波 余丽芳 赵杰 刘健 章必成 饶智国

·论著·

非小细胞肺癌PKM2的表达及与放疗敏感性的关系分析

王伟星 杨波 余丽芳 赵杰 刘健 章必成 饶智国

目的 探讨非小细胞肺癌患者PKM2的表达情况与放疗敏感性的关系。方法 取门诊就诊的非小细胞肺癌患者68例为研究对象，所有患者病例均经临床和手术病理确诊。对入组患者放射治疗，根据放疗敏感性分为A、B 2组：A组为对放疗敏感患者，B组为对患者不敏感患者。取放疗前手术切除的肿瘤组织，免疫组化技术法检测PKM2蛋白的表达情况；RT-PCR法检测PKM2的mRNA表达情况；Western blot 检测PKM2蛋白表达情况。结果 通过免疫组化发现，PKM2蛋白在A组和B组的高表达率分别为21.62%(8/37)和58.06%(18/31)，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR发现，与A组比较，B组PKM2mRNA的表达明显上升(P<0.05)。Westernblot检测结果显示，与B组比较，A组PKM2蛋白表达水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。结论PKM2的表达与非小细胞肺癌的放疗敏感性呈显著负相关，这表明PKM2 的表达可作为预测非小细胞肺癌患者放疗敏感性的重要分子标志，从而实现非小细胞肺癌患者的个体化治疗。

PKM2；非小细胞肺癌；放疗敏感性

肺是人体最主要的呼吸器官，统计学研究发现，肺癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中已居于首位，并且其发病率呈逐年增加的趋势，它已成为危害生命健康的一种主要疾病。从组织学上来说，肺癌可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。其中非小细胞肺癌占75%～90%[1]，其发病率远高于小细胞肺癌[2]。并且统计发现它的五年无进展生存率甚至不到15%[3]。肺癌的治疗方法有很多，如手术、内分泌、放疗、化疗等，对于非小细胞肺癌患者来说，放疗仍然占主导地位。但不同的患者，就算病理特征、年龄等没有差异，对放疗的敏感性也存在相当大的差异，这是影响放疗效果的主要因素[4]。肿瘤细胞对放射线的敏感性和许多因素有关，随着医学分子生物学的发生发展，研究者们发现肿瘤细胞的有氧糖酵解是影响放射敏感性的关键因素。丙酮酸激酶(PK)是糖酵解过程的限速酶，它有M1、M2、L、R四种类型，近年来研究最多的是M2型(即PKM2)，研究发现它与很多肿瘤密切相关，如胃癌、直肠癌、胰腺癌等[5]，PKM2可以作为一个分子指标预测放疗疗效。本研究旨在探讨非小细胞肺癌患者PKM2的表达情况与放疗敏感性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 取2013年7月至2014年7月在我院门诊就诊的非小细胞肺癌患者68例，所有患者经临床和手术病理确诊。纳入标准：(1)所有病例为首诊患者，之前未曾接受过内分泌、放化疗等抗癌治疗；(2)患者临床资料和随访记录完整；(3)患者身体状况佳可耐受放疗。所有患者签署知情同意书后，且经过医院伦理协会批准。男40例，女28例；患者年龄 42～66岁，平均年龄(57.11±4.2)岁;癌症分类：腺癌30例，鳞癌38例；分化程度：高分化11例，中分化34例，低分化23例；临床分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期21例，Ⅲ期32例；吸烟史：有吸烟史41例，无吸烟史27例。根据患者接受放射治疗后疾病缓解情况判断患者对放疗的敏感程度，将所有患者分为A、B组：A组为对放疗敏感患者，B组为对患者不敏感患者。分组依据：放疗敏感为完全缓解(CR)+部分缓解(PR)；放疗不敏感为疾病稳定(NC)+疾病进展(PD)。根据分组要求，A组37例、B组31例，2组患者临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 治疗 所有患者于手术治疗后3周左右接受三维放射治疗，仪器为美国瓦里安clinac23EX高能电子直线加速器。放射治疗实践为8周，患者放疗结束后1个月使用对放疗疗效进行评价。评价标准按照RECIST肿瘤疗效评价标准[6]：完全缓解(CR)，所有目标病灶经治疗完全消失，并且至少维持4周以上；部分缓解(PR)，基线病灶的最大径之和至少减少30%，至少维持4周；疾病稳定(SD)，基线病灶最大径之和有减少但未达PR或有增加但未达PD；疾病进展(PD)，基线病灶最大径之和至少增加25%或出现新病灶。

1.3 免疫组化法检测放疗前后PKM2的表达情况 病理标本来源于放疗前手术切除的肿瘤组织，标本处理方法：组织用甲醛固定，石蜡包埋切片；按照免疫组化试剂盒说明书孵育一抗、孵育二抗，并染色，试剂盒购自北京中杉金桥生物公司。一抗为鼠抗人PKM2抗体、二抗及染色试剂购Santa公司。

1.4RT-PCR检测PMK2mRNA表达情况 病理标本来源于放疗前手术切除的肿瘤组织，组织标本先后进行RNA的提取、逆转录、PCR扩增、PCR产物琼脂糖凝胶电泳，最后凝胶分析系统进行拍照，然后用Quantityone凝胶分析软件进行差异分析，整理分析相关数据。PKM2基因引物序列5’-GGGAGCCACTCTCAAAATCA- 3’(上游)；5’-ACCTTTTCTGCTTCACCTGGA-3’(下游)。

1.5Westernblot检测PKM2蛋白表达情况 病理标本来源于放疗前手术切除的肿瘤组织，进行蛋白的提取(Qiagen组织提取试剂盒)、电泳分离(150V稳压)、电转至NC膜(50mA恒流)、封闭以及孵育抗体(一抗、二抗)、显影以及定影、结果分析(用ImageQuant1.19对凝胶剂进行扫描和定量分析)

2 结果

2.1 免疫组化法检测放疗前后PKM2的表达情况 每张切片于10×40倍镜下随机取5 个视野进行观察，分别计数染色的阳性细胞占全部癌细胞的百分比。当阳性细胞率为51%～100%为高表达，阳性细胞率小于50%时则为低表达。68例中高表达26例，高表达率为38.24%，A组和B组高表达率分别为21.62%(8/37)和58.06%(18/31)，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。表明PKM2的表达与非小细胞肺癌的放疗敏感性呈显著负相关(P<0.05)。见表1。

表1 PKM2蛋白在非小细胞肺癌患者中的表达情况

2.2RT-PCR检测PKM2mRNA表达情况 用RT-PCR的方法检测2组PKM2mRNA的表达。与A组比较，B组PKM2mRNA的表达明显上升(P<0.05)，这显示PKM2mRNA的表达与非小细胞肺癌的放疗敏感性呈显著负相关，即PKM2mRNA低表达的非小细胞肺癌患者对放射治疗更加敏感。见图1、2。

2.3Westernblot检测PKM2蛋白表达情况Westernblot检测结果显示，与B组比较，A组PKM2蛋白表达水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，这显示PKM2 蛋白的表达与非小细胞肺癌的放疗敏感性呈显著负相关，即PKM2 蛋白表达越高，对放射治疗越不敏感。见图3、4。

3 讨论

肺癌是最常见的一种恶性肿瘤，全球统计学数据显示，该病的发病率和死亡率在所有癌症中位列第一[7]，该病严重威胁患者身心健康，影响患者生活质量，全球每年新发病例高达135.16万，在我国肺癌患者占全部肿瘤患者的12%～13%。肺癌可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌占75%～90%[8]，并且统计发现非小细胞肺癌患者的五年无进展生存率甚至不到15%，其中临床分型为Ⅰ期的患者，五年无进展生存率也仅仅只有60%左右[9]。临床医生在制定人小细胞肺癌患者的治疗方案时，放疗仍然是必不可少的选择手段[10]。肿瘤放射治疗(放疗)是利用各类射线生成机产生射线、电子线等来治疗肿瘤的一种特殊方法。医生在制定非小细胞肺癌放疗模式时，剂量及频次均参考标准治疗规范的推荐，事实上，不同肿瘤患者对放射线的敏感性不同，有的治疗效果良好，有的则完全没有效果，甚至还有一部分患者出现明显的不良反应[11]。那么，假如在患者接受放疗之前我们就能预测患者的治疗效果，就可以针对不同患者设计不同的放疗方案，提高疗效，尽可能的减少患者的不良反应，从而实现患者的个体化治疗[12]。但是，国内外的专家学者至今没有找到一个可以用来预测非小细胞肺癌患者放疗敏感性的一个生物标志物。

图1 RT-PCR检测PKM2 mRNA表达情况凝胶成像分析仪扫描电泳图

图2 RT-PCR检测PKM2 mRNA表达情况柱状分析图

图3 Western blot 检测PKM2蛋白表达情况

图4 Western blot 检测PKM2蛋白表达情况柱状分析图

随着医学分子生物学的发生发展，研究者们逐渐把研究方向指向有氧糖酵解过程的限速酶PKM2。糖酵解在肿瘤的发生发展中发挥关键作用，它是肿瘤细胞供能的主要方式，由于糖酵解过程在无氧的环境下也能进行，肿瘤的这种代谢方式赋予了肿瘤细胞生长的优势[13]。丙酮酸激酶(PK)是糖酵解过程的限速酶，它有M1、M2、L、R四种类型，研究发现PKM2在肿瘤细胞中高表达，而在正常细胞中表达较低[14]。许多研究均证实，血液及粪便中PKM2的检测可以明确肿瘤诊断、判断肿瘤临床分期以及分析肿瘤是否转移，这一方法可以应用于食管癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等[15]，另外还有研究表明PKM2的表达水平与放疗的敏感性密切相关[16]。

本研究为了证实探讨非小细胞肺癌患者PKM2的表达情况与放疗敏感性的关系，检测放疗敏感患者与不敏感患者癌组织中PKM2mRNA及蛋白的表达水平，通过免疫组化发现，PKM2蛋白在放疗敏感患者和放疗不敏感患者的高表达率分别为21.62%(8/37)和58.06%(18/31)，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR发现，与A组比较，放疗不敏感患者PKM2mRNA的表达明显上升(P<0.05)。Westernblot检测结果显示，与放疗不敏感患者比较，放疗敏感患者PKM2蛋白表达水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。这提示PKM2的表达与非小细胞肺癌的放疗敏感性呈显著负相关，即PKM2在癌细胞中表达水平越低，患者对放疗就越敏感。分析其潜在的机制，PKM2在肿瘤的发生发展中除了调节糖酵解之外，还与一些癌基因发生作用，共同影响肿瘤生长。有研究发现，PKM2能影响Bax和Bak的表达，Bax和Bak是调节细胞凋亡过程。近期还有研究发现，PKM2能通过EGRF通路来调节cyclinD1和c-myc的表达[17]，cyclinD1和c-myc是重要的细胞增值调控因子。这些基因均是肿瘤的生长过程的关键因子，因此我们推测肿瘤组织中PKM2的水平不一样，影响了凋亡基因Bax和Bak以及细胞增值调控因子cyclinD1和c-myc的表达，使得肿瘤组织对放射的敏感性发生改变。

综上所述，PKM2的表达与非小细胞肺癌的放疗敏感性呈显著负相关，这表明PKM2 的表达可以作为预测非小细胞肺癌患者放疗敏感性的重要分子标志，从而实现非小细胞肺癌患者的个体化治疗。

1 赵真真,王忠敏,茅爱武.非小细胞肺癌的介入治疗现状.介入放射学志,2014,23:272-276.

2KomakiR,TsaoAS,MehranRJ.Non-SmallCellLungCancer.SpringerNewYork,2013.45-62.

3 钟幸,王瑾.EGFR突变与非小细胞肺癌放射治疗进展.中国肺癌杂志,2013,16:157-161.

4WangXC,DuLQ,TianLL,etal.ExpressionandfunctionofmiRNAinpostoperativeradiotherapysensitiveandresistantpatientsofnon-smallcelllungcancer.LungCancer,2011,72:92-99.

5KumarY,MazurekS,YangS,etal.InvivofactorsinfluencingtumourM2-pyruvatekinaselevelinhumanpancreaticcancercelllines.TumourBiol,2010,31:69-77.

6 尹利杰,赵莹莹.非小细胞肺癌组织PKM2 和K-ras基因蛋白表达及其与放疗敏感相关性的探讨.中华肿瘤防治杂志,2010,17:1080-1082.

7JemalA,BrayF,CenterMM,etal.Globalcancerstatistics.CACancerJClin,2011,61: 69-90.

8ZarogoulidisK,ZarogoulidisP,DarwicheK,etal.Treatmentofnon-smallcelllungcancer(NSCLC).JThoracDis,2013,5:389-396.

9 徐燕梅.血浆miRNAs预测非小细胞肺癌患者放疗敏感性的研究.第三军医大学.2014.

10BradleyJD,PaulusR,KomakiR,etal.ArandomizedphaseIIIcomparisonofstandard-dose(60Gy)versushigh-dose(74Gy)conformalchemoradiotherapywithorwithoutcetuximabforstageIIInon-smallcelllungcancer:ResultsonradiationdoseinRTOG0617.JClinOncol,2013,31:7501.

11WangXC,DuLQ,TianLL,etal.ExpressionandfunctionofmiRNAinpostoperativeradiotherapysensitiveandresistantpatientsofnon-smallcelllungcancer.LungCancer,2011,72:92-99.

12 崔爽爽.MicroRNA表达与非小细胞肺癌放疗敏感性关系的研究.中国协和医科大学学报,2013,19:565-569.

13 周成富.丙酮酸激酶亚型的表达上调对大肠癌细胞糖代谢和肿瘤生长、转移的影响.中山大学学报,2012,33:481-483.

14ChanetonB,GottliebE.Rockingcellmetabolism:revisedfunctionsofthekeyglycolyticregulatorPKM2incancer.TrendsBiochemiSci,2012,37:309-316.

15 钱泽.PKM2在肝内胆管癌中的表达及其致癌作用.浙江大学，2015.

16 尹晨希,周菲菲,夏良平.恶性肿瘤患者血清中PKM2水平的诊断和预后预测价值.肿瘤学杂志,2013,19:565-569.

17 吕磊,汪良,蒋国松,等.沉默PKM2 增强藤黄酸诱导人前列腺癌PC3细胞凋亡的敏感性.中国男科学杂志,2013,19:102-106.

Expression of PKM2 in non-small cell lung cancer and its correlation with radiotherapy sensitivity

WANGWeixing,YANGBo,YULifang,etal.

DepartmentofOncology,WuhanGeneralHospitalofPLA,Wuhan430070,China

Objective To investigate the expression of PKM2 in non-small cell lung cancer and its correlation with radiotherapy sensitivity.Methods Sixty-eight patients with non-small cell lung cancer who were treated in our hospital from July 2013 to July 2014 were enrolled in the study. All the patients were diagnosed by clinical and operative pathology and were treated by radiotherapy. According to radiotherapy sensitivity,these patients were divided into group A (sensitivity to radiotherapy) and group B (non-sensitivity to radiotherapy).The expression levels of PKM2 in surgical ablation tumor tissues before radiotherapy were detected by immunohistochemistry,the expression levels of PKM2 mRNA were detected by RT-PCR and the expression levels of PKM2 protein were detected by Western Blot.Results The immunohistochemistry examination showed that the high expression rate of PKM2 in group A and group B was 21.62%(8/37)and 58.06%(18/31), respectively,there was a significant difference between two groups (P<0.05).TheresultsbyRT-PCRshowedthattheexpressionlevelsofPKM2mRNAingroupBweresignificantlyincreased,ascomparedwiththoseingroupA(P<0.05).WesternBlottingrevealedthattheexpressionlevelsofPKM2proteiningroupAwereobviouslydecreased,ascomparedwiththoseingroupA(P<0.01).Conclusion The expression of PKM2 is negatively correlated with radiotherapy sensitivity,which shows that the expression of PKM2 can be regarded as an important molecular mark to predict radiotherapy sensitivity in patients with non-small cell lung cance so as to realize individualized treatment.

PKM2；non-small cell lung cancer; radiotherapy sensitivity

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.04.006

项目来源：湖北省自然科学基金项目(编号：2012FFA071)

430070 武汉市，中国人民解放军武汉总医院肿瘤科

饶智国，430070 武汉市，中国人民解放军武汉总医院肿瘤科；

E-mail:raozhiguo@hotmail.com

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A

1002-7386(2017)04-0504-04

2016-06-12)