荷斯坦牛LF基因5’UTR区多态性分析

周秀敏，李强子，毕英杰，任卫合，张丽

（西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030）

荷斯坦牛LF基因5’UTR区多态性分析

周秀敏，李强子，毕英杰，任卫合，张丽

（西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030）

本研究采用PCR-SSCP技术对303头奶牛的乳铁蛋白基因5’UTR区进行遗传多态性检测，以确定其等位基因数以及核苷酸变异位点，探讨其遗传特性结果表明，LF基因在扩增区域的64bp处发生G→C的突变，形成AA、AB、BB三种基因型，其基因型频率分别为0.2541、0.4455和0.3004，等位基因A和B的频率分别为0.4796和0.5231。群体遗传学分析发现荷斯坦牛LF基因的有效等位基因数(Ne)、遗传杂合度(He)和多态信息含量（PIC）分别是0.4989、0.4455和0.3745。经卡方适合性检验表明该群体处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）。中国荷斯坦牛LF基因5’UTR区的多态性相对较高，遗传变异相对较大，提示该位点有望作为荷斯坦牛乳腺炎抗病育种的标记位点之一。

荷斯坦牛；LF基因；PCR-SSCP；遗传多态性

乳铁蛋白( Lactoferrin, LF)作为转铁蛋白家族的成员，不仅具有抑制细菌生长、抗病毒、免疫调控的作用[1～3]，同时还能刺激免疫应答及溶菌酶再生等生理功能[4]。LF基因被定位于牛的第22号染色体上，包括17个外显子和16个内含子[5]。近年来大量学者对荷斯坦牛乳铁蛋白及其编码基因进行了研究。Sordillo等[6]研究发现乳铁蛋白的浓度是可遗传的。Molenaar等[7]表明LF基因的表达与炎症反应相关联。Dinesh[8]等发现摩拉水牛LF基因第7外显子上存在的SNPs与乳腺炎显著相关；Carvajal等[9]报道LF基因启动子区c.-28A＞C 突变位点与乳腺炎抗性相关；Singh等[10]发现，在瘤牛LF基因上的g.31566A＞T、g.31649A＞C和g.31566A＞T三个突变位点对SCC的影响达到极显著水平（P＜0.01）；陈仁金等[11]报道，在LF基因外显子1发现的c.63C＞G突变与乳腺炎抗性相关。

本研究通过PCR-SSCP技术对荷斯坦牛LF基因5’UTR区进行了多态性分析，旨在丰富荷斯坦牛乳铁蛋白基因库，并为有关抗病性基因的筛选提供分子理论资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集及基因组DNA提取

试验所用血样采自宁夏贺兰山奶业有限公司的303头荷斯坦牛，用医用采血管尾静脉采血10mL，-20℃保存。采用试剂盒法从冻存牛血中提取基因组DNA，-20℃保存备用。

1.2 引物设计与PCR扩增

根据牛已知的L F基因序列（G e n B a n k no.∶ AY319306），应用Primer6.0软件设计1对特异性引物，用于扩增荷斯坦牛L F基因5’U T R区。其上下游引物序列分别为：5’-TGGATAAAGGGACGCAGAACG-3’，5’-CACTGAGGGGTGAGGGGACT-3’，该引物由大连宝生物公司合成。PCR扩增体系总体积为20μL：基因组DNA模板2μL，上下游引物各1μL，Taq PCR MasterMix 10μL，ddH2O 6μL。PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存，并用1%琼脂糖凝胶对扩增结果进行检测。

1.3 SSCP分析与等位基因序列的回收测定

取3μL的PCR产物，加入7μL变性上样缓冲液（0.025%溴酚蓝、98%去离子甲酰胺、10mmol/L EDTA、0.025%二甲苯氰），98℃变性10min后再立即冰浴10min。将变性后的PCR产物点样至10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上（Acr∶Scr=39∶1），160V电压室温电泳2～3h。结束后用银染法染色，确定PCR产物的基因型。PCR扩增产物经过SSCP确定基因型后，纯合子PCR产物用试剂盒回收后直接送北京华大公司测序。而杂合子个体则参照Hu等[12]介绍的方法进行处理。

1.4 统计分析

利用Popgene32软件计算出LF基因不同突变位点的等位基因频率、基因型频率、有效等位基因数(Ne)、遗传杂合度(He)和多态信息含量（PIC），并对该位点基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验及核苷酸序列的比对分析。

2 结果与分析

2.1 荷斯坦牛LF 基因PCR扩增结果

对303头荷斯坦牛的DNA样品进行扩增后，经1%琼脂糖凝胶（100V，30min）电泳检测后均得到一条如图1所示的特异性好、条带清晰、长度约为215bp的PCR产物，且与预期的目的片段大小一致，可用于SSCP检测。

图1 荷斯坦牛LF基因5’UTR 区PCR扩增产物检测结果

2.2 PCR-SSCP检测及序列测定结果

荷斯坦LF基因5’UTR区序列区域共检测到2种等位基因A和B，共形成AA、BB、AB三种基因型（图2），其中等位基因A和B均具有纯合型个体。PCR产物纯化克隆后的测序结果显示，扩增片段长度为215bp，在GenBank中基因引物扩增区域核苷酸序列与荷斯坦牛LF基因序列的同源性在97%以上，表明扩增产物的确为荷斯坦牛LF基因。与普通牛LF 基因（GenBank no. AY319306）序列对比发现在扩增区域的64bp处发生了一个G→C的碱基突变（图3）。

图2 荷斯坦牛LF基因5’UTR区 PCR产物SSCP检测结果

图3 荷斯坦牛和普通牛LF基因5’UTR区等位基因序列比对

2.3 遗传参数分析

荷斯坦牛LF基因5’UTR区基因型频率、基因频率以及各遗传多态性指标见表1和表2。等位基因A和B的频率分别为0.4769和0.5231，AA、BB和AB基因型的频率分别为0.2541、 0.3004和0.4455。本研究中，荷斯坦牛LF基因的有效等位基因数(Ne)、遗传杂合度(He)和多态信息含量（PIC）分别是0.4989、0.4455和0.3745。0.25＜PIC≤0.5属于中度多态，说明该位点遗传多态性较丰富。经χ2适合性检测表明，荷斯坦牛在该位点未偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）。

表1 荷斯坦牛LF 基因5’UTR区的基因型频率和等位基因频率

表2 荷斯坦牛LF 基因5’UTR区遗传多态性分析

3 讨论

有关荷斯坦牛LF基因多态性的研究报道颇多。Li等[13]研究发现LF基因c.+33C＞A、c.-28C＞A、c.-810C＞T、c.-838G＞T、c.-926G＞A、c.-915T＞G、c.460G＞C、c.1062G＞T、c.1119C＞T、c.1176T＞C、c.1889T＞C共11个SNPs，其研究结果与Seyfert. H[14]研究报道的基本一致。李国华等[15]在外显子7和12上没有发现SNPs，而Dinesh[8]在水牛LF基因外显子7和12上发现2个SNPs。Kaminski等[16]发现LF基因上存在与Li[13]相同的c.+33C＞A位点；郭亮等[17]在荷斯坦牛LF基因上共检测到6个SNPs，其中c.+33C＞A、c.-926G＞A、c.-28C＞A与 Li[13]研究结果一致，c.-945G＞A、c.439A＞G，c.1889T＞C为3个新发现的SNPs。Kathiravan等[18]在水牛LF基因检测到c.1437G＞A、c.1298G＞A 2个SNPs。本研究通过对宁夏荷斯坦牛LF基因5’UTR区遗传多态性分析发现扩增片段64bp处发生G→C的突变，但是在其外显子1上并未发现陈仁金[11]的c.63C＞G突变位点，这可能是由于所研究荷斯坦牛群体的遗传背景和基因与环境相互作用不同而造成的差异。

本研究通过对荷斯坦牛LF基因5’UTR区进行的遗传多态性分析结果表明，该群体未偏离Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05），PIC介于0.25～0.5之间，表现为中度多态，这极可能是选择压造成的。由此看出荷斯坦牛群体在此位点的多态性相对较高，遗传变异相对较大，提示该位点有望作为荷斯坦牛乳腺炎抗病育种的标记位点之一。

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Polymorphism Analysis of LF Gene 5’UTR Region in Holstein Cattle

ZHOU Xiu-min, LI Qiang-zi, BI Ying-jie, REN Wei-he, ZHANG Li
(College of Life Science and Engineering, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030)

Polymorphism,allele number,nucleotide polymorphism sites and amino acid polymorphism sites of LF gene 5’UTR region in 303 Holstein cows were studied. Polymorphisms of LF gene 5’UTR region were detected by polymerase chainreaction-single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP) . The results showed that LF gene was identifted of having a G to C mutation at position 64. Three genotypes were found and genotypic frequencies of AA , AB and BB were 0.2541、0.4455 and 03004, erspectively. The allele frequencies of A and B were 0.4796 and 0.5231.Chi-square test Indicated that the polymorphic locus in Chinese Holstein cattle population ftted Hardy-Weinberg equilibrium(P＞0.05). The fnding showed that polymorphism of LF gene 5’UTR region in Holstein cattle was medium, it was expected to be a marker for anti-mastitis disease breeding in Holstein cattle.

Holstein cattle; LF gene; PCR-SSCP;Polymorphism

S823.3

A

1004-4264（2017）03-0013-03

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.03.004

2016-10-31

西北民族大学引进人才科研项目（xbmuyjrc201316），西北民族大学生命科学与工程学院众创空间扶持项目。

周秀敏（1996-），女，江苏盐城人，在读本科生。

张丽。