重庆地区无偿献血人群隐匿性乙型肝炎病毒感染的特征

张 涛，廖红梅，张春红，谭茜茜，毛 伟，黄 霞

重庆地区无偿献血人群隐匿性乙型肝炎病毒感染的特征

张 涛，廖红梅，张春红，谭茜茜，毛 伟，黄 霞

目的了解重庆地区无偿献血人群中隐匿性乙型肝炎病毒感染（occult hepatitis B virus infection, OBI）情况，分析其血清学和病毒学特征。方法应用酶联免疫法（筛查HBsAg、抗-HCV、抗-HIV）及核酸检测（nucleic acid testing, NAT）法（筛查HBV、HCV、HIV）筛查重庆地区93 625份初筛合格的无偿献血者血液标本。对其中HBsAg（-）但HBV DNA（+）的标本进行抗-HBs、抗-HBc、HBeAg、抗-HBe 4项血清学标志物测定，进一步对抗-HBc（+）标本做病毒载量测定以及基因分型。结果93 625份标本中HBsAg（-）但HBV DNA（+）的检出率为0.097%（91/93 625）。91份阳性标本中79份为抗-HBc（+），检出率为0.084%（79/93 625）。该部分标本阳性者被视为OBI献血者。OBI献血者的血清学特征可以分为4种模式：单抗-HBc（+）、抗-HBc（+）/抗-HBs（+）、抗-HBc（+）/抗-HBe（+）以及抗-HBc（+）/抗-HBs（+）/抗-HBe（+）。病毒载量为0～1056.8 IU/ml（中位数为108.6 IU/ml），基因型以B型为主。结论重庆地区无偿献血者中OBI检出率较高，其血清学和病毒学特征具有地区性。NAT能提高OBI检出的灵敏度，但也存在一定的假阳性，对血液安全具有重要影响。

核酸检测；隐匿性乙型肝炎病毒感染；血清学特征；病毒学特征

近年来随着分子生物学技术在病毒检测中的应用，发现在HBsAg（-）的人群中可检出HBV DNA，这种除窗口期外的HBsAg（-）但HBV DNA（+）的感染被定义为隐匿性乙型肝炎病毒感染（occult hepatits B virus infection, OBI）[1]。OBI是HBV感染的一种特殊类型[2]，流行于世界各地，与 HBV流行率呈正相关。我国是 HBV感染的高流行区，在无偿献血人群中，OBI具有较高的流行率[3]，是影响血液安全的一个潜在因素。我们利用重庆市血液中心推行核酸检测（nucleic acid testing, NAT）的机会，收集了本中心2012—2013年HBsAg（-）但HBV DNA（+）的献血者标本，通过筛查抗-HBc（+）排除窗口期影响，对确定为OBI的部分标本进行血清学及病毒学特性分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2012年10月—2013年9月于本中心采集的93 625份无偿献血者标本。献血者均符合《献血者健康检查要求》（GB18467-2011）的规定。其中，男48 542例，女45 038例，平均年龄为（31.3±4.0）岁，最小19岁，最大55岁。经HBsAg及ALT初筛合格后的标本送检验科分别行酶联免疫法和NAT检测。最后收集HBsAg（-）但HBV DNA（+）无偿献血者标本血浆20 ml，-80 ℃冻存备检。

1.2 试剂及仪器 ALT检测（上海科华、瑞士澳斯邦）；HBsAg检测（北京万泰、生物梅里埃）。抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc（ELISA法）检测试剂盒（上海科华）；HBV、HCV、HIV-1NAT试剂盒、PROCLEIX TIGRIS 核酸检测系统（美国诺华）； HBV DNA提取试剂盒和荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa）；HBV基因分型检测试剂盒（珠海赛乐奇）；RSP150和RSP200型全自动样品处理仪（瑞士帝肯）；FAME24/20和FAME24/30型全自动酶联免疫分析系统（瑞士哈米尔顿）；酶标仪（美国BIO-TEK）；超速离心机（SIGMA）；实时荧光定量PCR仪（ABI 7500）。

1.3 方法

1.3.1 HBsAg检测 对93 625份无偿献血者标本用全自动酶联免疫分析仪使用2种不同厂家试剂分别对HBsAg进行ELISA法检测，设置S/CO≥0.8为有反应性，0.8≤S/CO＜1.0为灰区。双试剂S/CO均≥0.8，直接判定为阳性；单试剂有反应性标本采用原试剂进行双孔复试，至少1孔有反应性判定为阳性。

1.3.2 病毒核酸检测 采用ULTRIO试剂进行HIV RNA、HCV RNA、HBV DNA三联检测分析。对于ULTRIO有活性的标本，判定为NAT联检阳性，再分别进行Procleix HIV、HCV 和HBV鉴别试验。收集上述ELISA检测HBsAg（-）但NAT检测（+）的献血者标本血浆50 ml，-80 ℃冻存。

1.3.3 HBV血清标志物检测 对HBsAg（-）但HBV DNA（+）的标本进行4种血清标志物（抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc）ELISA检测，按试剂盒说明书操作，酶标仪上判读结果。标本S/CO≥1判定为阳性，标本S/CO＜1时，判定为阴性。

1.3.4 病毒核酸提取 将收集的ELISA检测HBsAg（-）但NAT检测（+）的献血者血浆予以解冻，充分振荡混匀，进行超速离心浓缩处理。每份样品取20 ml分装于10支2 ml Axygen离心管（2 ml/管），4 ℃ 12 000×g离心0.5 h，吸取上清850 μl弃去，留底部浓缩液150 μl。收集各管浓缩液，并用所弃上清液调整终体积至2.0 ml，获得10倍浓缩标本。严格按试剂说明书操作提取浓缩所得的2 ml/份血浆中的HBV DNA。

1.3.5 病毒载量测定 方法参照文献[4]。HBV-1引物序列：5'-CAA CCT CCA ATC ACT CAC CAA C-3'。HBV-2引物序列：5'-ATA TGA TAA AAC GCC GCA GAC AC-3'。双标探针BS-1：5'-（Cy5） TCC TCC AAT TTG TCC TGG TTA TCG CT-（BH Q2） -3'（上海生工合成）。反应体系25 μl：2×Premix Ex Taq 12.5 μl，Rox DyeⅡ0.4 μl，HBV-1（10.0 μmol/L）终浓度 0.4 μmol/L，HBV-2（10.0 μmol/L）终浓度0.4 μmol/L，探针BS-1（5.0 μmol/L）终浓度0.2 μmol/L；反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，42个循环。

1.3.6 病毒基因分型 取直用型PCR反应液（PCR小管）室温下融化、离心，加入所提HBV DNA 2 μl混匀，离心10 s。PCR扩增反应条件：95 ℃10 min；94 ℃ 30 s ，56 ℃ 30 s ，72 ℃ 30 s ，50个循环；72 ℃ 5 min。取10 μlPCR扩增产物解链后与基因分型芯片杂交、显影，判读结果。

1.4 统计学处理 用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料呈正态分布，用±s或中位数（最小值，最大值）表示。多组间定量资料差异性比较用单因素方差分析，两两比较用最小显著差法。多组间率的比较用R×C χ2检验，两两比较用Scheffe法。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 重庆市OBI无偿献血者血清学特征 初筛合格的93 625份无偿献血者标本中HBsAg（-）但HBV DNA（+）检出率为0.097%（91/93 625），对91份HBV DNA（+）标本进行HBV血清学标志物检测，79份为抗-HBc（+）标本，表明献血者既往有HBV感染从而排除窗口期感染，确认为OBI，检出率为0.084% (79/93 625)。其中初次献血者31例（39%）、重复献血者48例（61%），男性54例（68%）、女性25例（32%）。其余12例标本无血清学标志物，不能排除窗口期影响，须进行连续追踪检测。

根据血清学标志物结果，分为4种血清学模式，79例OBI献血者中抗-HBc（+）占40.5%，抗-HBc（+）/抗-HBs（+）占26.5%，抗-HBc（+）/抗-HBe（+）占24.1%，抗-HBc（+）/抗-HBs（+）/抗-HBe（+）占8.8%。总体上各血清学模式组在献血次数、年龄、性别和ALT方面差异均无统计学意义，见表1。此外，不存在抗-HBs（+）/抗-HBe（+）及单独抗-HBe模式。

2.2 重庆市OBI献血者HBV分子生物学特征 实时荧光定量PCR检测结果显示，79例OBI献血者HBV载量均为低水平，范围为0～1056.8 IU/ml（中位数为108.6 IU/ml）（图1）。对能定量的63份OBI献血者进行基因型检测，45例为B型（71.4%），12例为C型（19.1% ），6例不能确定基因型（表2）。

3 讨 论

重庆是HBV的高发地区[5]，推测OBI献血者在无偿献血人群中流行率较高。本研究利用血液中心核酸检测系统筛选出HBsAg（-）但HBV DNA（+）的献血者，通过检测抗-HBc（+）排除窗口期影响，剩余部分被认定为OBI献血者，其检出率为0.084%（79/93 625），高于深圳、香港等地区报告的检出水平[6]。须要注意的是，通过检测抗-HBc（+）排除窗口期，可能漏检小部分OBI献血者，此类献血者只有通过追踪检测才能确认，本研究中暂未涉及。分析筛选出的79例OBI献血者的血清学特征，抗-HBc（+）占40.5%，抗-HBc（+）/抗-HBs（+）占26.5%，抗-HBc（+）/抗-HBe（+）占24.1%，抗-HBc（+）/抗-HBs（+）/抗-HBe（+）占8.8%。各组间在献血次数、年龄、性别和ALT方面均无显著差异。这一方面表明长期反复暴露在HBV高流行环境中是导致OBI的一个重要原因，另一方面提示我们必须重视抗-HBc指标的应用。虽然在我国健康人群中抗-HBc阳性率（34.11%）本身较高[7]，将其作为献血者筛查指标会淘汰大多数合格献血者，但可以在窗口期排查、追踪调查OBI献血者时使用该指标了解血清学状态[8]。另外2种血清学模式抗-HBc（+）/抗-HBs（+）与抗-HBc（+）/抗-HBe（+）比例基本一致，这2种模式的存在表明OBI献血者不仅存在HBsAg变异，而且其捐献的血液同样具有传播HBV的风险。3种抗体都存在的比例较小，但也表明OBI献血者中同样有抗-HBs（+）与抗-HBe（+）共存的情况。抗-HBs常被认为是一种保护性抗体，而抗-HBe则常被作为HBV复制的一个指标，2者共存的现象提示OBI献血者可能存在HBV免疫逃亡情况。

表1 重庆地区79例OBI献血者一般资料和血清学特征Table1 Generally data and serological features of 79 OBI cases in Chongqing region

图1 实时荧光定量PCR检测OBI 献血者（部分）病毒载量水平Figure1 HBV viral load levels of OBI donors detected by QPCR

表2 重庆地区63例OBI献血者病毒学特征Table 2 Virological characteristics of 63 OBI donors in Chongqing

在病毒学特征方面，OBI献血者最显著的特征是血液中的HBV DNA载量均较低[6]。近年来开展的NAT技术，与实时荧光定量PCR等方法相比，具有较高的灵敏度，极大提升了HBV DNA的检出率。虽然NAT较为灵敏，但也存在假阳性的可能。因此，我们采用实时荧光定量PCR的方法进一步对NAT（+）的结果进行确认，同时进一步确认了OBI献血者的病毒载量水平。采用实时荧光定量PCR法往往不能检出OBI献血者中的HBV DNA，本研究中采取超速离心浓缩法[9]对献血者血浆中的病毒进行了富集处理，显著提高了检出率，对病毒载量进行了准确定量和基因分型。结果显示，63份OBI献血者病毒载量在0～1056.8 IU /ml（中位数为108.6 IU /ml）之间，与已有的报道一致[10]；基因分型以B型为主，与我国南方地区HBV主要为B型，北方地区主要为C型分布情况相同[11]。此外，有16份标本虽经超速离心浓缩并使用目前较为灵敏的实时荧光定量PCR的商品化试剂盒进行检测仍未检测出HBV DNA，一方面可能是受实时荧光定量PCR方法的局限造成假阴性结果，另一方面也可能是献血者本身是真阴性，而NAT结果为假阳性。基于这2种检测方法结果的差异，采用实时荧光定量PCR方法定期对NAT检测结果进行复核确认，将有助于深入了解NAT方法造成假阴性或假阳性的情况。

此外，NAT联检结果阳性的标本，有相当一部分标本在进一步做区分检测时难以区分出具体的病毒种类。这类NAT筛查阳性结果到底是混样检测导致的假阳性，还是由于病毒含量太低致不能被鉴别，须要引起我们足够的重视。在本次研究中，此类标本并未被纳入研究范围，但根据已有报告，其中相当一部分标本最终被确认为HBV[12]。因此，若将此部分标本加以考虑，重庆地区无偿献血者OBI的检出率应比本次研究结果更高，这类标本或许对研究OBI的血清学和病毒学特征更具有研究意义，当然这也需要更灵敏、准确的研究方法。

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（2016-05-04收稿 2016-12-23修回）

（本文编辑 闫晶晶）

Characterization of occult hepatitis B virus infection in Chongqing unpaid blood donors

ZHANG Tao*, LIAO Hong-mei, ZHANG Chun-hong, TAN Qian-qian, MAO Wei, HUANG Xia
Institute of Blood Transfusion, Chongqing Blood Center, 400015, China
*Corresponding author, E-mail: 93947742@qq.com

ObjectiveTo investigate the prevalence of occult HBV infection (OBI) of blood donors in Chongqing, and to analyze the characteristics of its serology and virology.MethodsA total of 93 625 prescreening acceptable blood samples were screened for HbsAg, anti-HCV and anti-HIV by EIAs, and tested for HBV, HCV and HIV-1 nucleic acids by nucleic acid test (NAT). HBsAg(-)/ HBV DNA(+) samples were detected for anti-HBc, anti-HBs, anti-HBe and HBeAg. And the anti-HBc(+) samples were further tested for viral loads and genotyping.ResultsThe detection rate of HBsAg(-)/HBV DNA(+) was 0.097% (91/93 625). Among 91 samples, 79 were positive for anti-HBc, the detection rate was 0.084% (79/93 625). These donors were called OBI. The OBI samples could be divided into 4 types according to serological tests, which were anti-HBc(+), anti-HBc(+)/anti-HBs(+), anti-HBc(+)/anti-HBe(+) and anti-HBc(+)/anti-HBs(+)/anti-HBe(+). According to the result of real-time fluorescent quantitative PCR(QPCR), all specimens of OBI´s viral load was 0-1056.8 IU/ml (median 108.6 IU/ml). The genotype was mainly B.ConclusionsOBI´s detection rate is higher in unpaid blood donors in Chongqing area, and the serology and virology characteristics are regionally. NAT can improve the sensitivity of OBI detection, but some results are false-positive, which have important effects on the blood safety.

nucleic acid testing; occult hepatitis B virus infection; serological characteristics; virology characteristic

R446.11；R512.6

A

1007-8134(2017)01-0044-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.01.014

重庆市卫生局医学科研项目（2012-2-483）

400015，重庆市血液中心输血研究所（张涛、廖红梅、张春红、谭茜茜、毛伟、黄霞）

张涛，E-mail: 93947742@qq.com